上述分子的體現(xiàn)了降解劑的結(jié)構(gòu)與應(yīng)用類(lèi)型的豐富性，但降解劑類(lèi)分子的合理設(shè)計(jì)與不斷優(yōu)化以及活性檢測(cè)仍有很長(zhǎng)的路要走。
 

前文我們已經(jīng)介紹過(guò)，PROTAC 分子的設(shè)計(jì)之初，靶蛋白配體、E3 連接酶配體和兩者中間的連接子三者應(yīng)該分別考量。

 

在 PROTAC 介導(dǎo)的蛋白降解途徑中，其中靶標(biāo)配體 (POI)-PROTAC-E3 連接酶等三元復(fù)合物的有效形成同樣起到重要作用。三元復(fù)合物的任一單元的濃度改變帶來(lái)的不僅僅是線性變化，“鐘” 形模型常常被用來(lái)解釋這樣的活性與濃度相關(guān)性，文獻(xiàn)中提及的 hook effect 也正是形容這種情形。

 

另外，在活性研究中，協(xié)同效應(yīng) (cooperativity, α) 這一詞匯，被用于解釋 PROTAC 受 POI 與 E3 連接酶配體間蛋白蛋白相互作用 (PPI) 的影響。當(dāng) α 大于 1 時(shí)，POI 和 E3 是正協(xié)同效應(yīng)，對(duì)三元復(fù)合物的形成有利。

 

圖 1. PROTAC 降解能力的“鐘”形模型與協(xié)同效應(yīng)示意圖^[1]

 

 

1. 依賴溶酶體途徑的降解類(lèi)分子

PROTAC 主要依賴泛素-蛋白酶體途徑，其對(duì)應(yīng)降解的大多為胞質(zhì)蛋白與核蛋白。Bertozzi 教授的研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一項(xiàng)靶向胞外蛋白的降解技術(shù)——溶酶體靶向嵌合體 (LYTAC)。已證明 LYTAC 成功降解了表皮生長(zhǎng)因子受體 (EGFR)、程序性死亡配體 1 (PD-L1) 等膜上蛋白。
 
對(duì)于細(xì)胞中一些非蛋白成分，Targeting lipid droplets for autophagic degradation by ATTEC 一文展示了一種通過(guò)自噬束縛化合物 (ATTECs) 降解非蛋白質(zhì)生物分子的新策略，使用脂滴作為示例靶標(biāo)并成功降解。

 
但不論是 PROTAC 還是上述其他方式，它們都靶向真核生物細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的降解，均不能在細(xì)菌和其他原核生物中發(fā)揮功能。
 
2. 依賴 ClpCP 酶的 BacPROTAC

今年 6 月，Morreale 團(tuán)隊(duì)等人在 Cell  發(fā)表的 BacPROTACs mediate targeted protein degradation in bacteria 一文報(bào)道了一種用于革蘭氏陽(yáng)性菌和分枝桿菌靶向蛋白降解的創(chuàng)新技術(shù)，BacPROTAC。

 

他們基于 Clausen 實(shí)驗(yàn)室之前的一項(xiàng)發(fā)現(xiàn)：在枯草芽孢桿菌和其他革蘭氏陽(yáng)性菌中，AAA 去折疊酶 ClpC 和蛋白酶 ClpP 組成的 ClpC–ClpP (ClpCP) 蛋白酶是降解細(xì)菌中未折疊和聚集蛋白質(zhì)的重要蛋白水解酶。由于磷酸精氨酸的對(duì)接位點(diǎn)位于 ClpC ATP 酶的氨基末端結(jié)構(gòu)域，磷酸精氨酸 (pArg) 可作為 ClpCP 蛋白酶復(fù)合體的降解標(biāo)簽。

 

Morreale 等人報(bào)道的細(xì)菌 PROTACs (BacPROTACs) 由 POI 配體、Linker 和 ClpC_NTDs 配體組成，可誘導(dǎo)細(xì)菌這種沒(méi)有泛素蛋白酶體的非真核生物蛋白的體內(nèi)外降解。如圖 3A，研究團(tuán)隊(duì)在體外首先以單體鏈霉親和素 (mSA) 作為模型蛋白，通過(guò) BacPROTAC 將 pArg (ClpC_NTD 配體) 與生物素 (mSA 的配體) 結(jié)合，形成 BacPROTAC-1 三元復(fù)合物，有效降解靶蛋白。BacPROTAC-1 與 mSA 和 ClpC_NTD 結(jié)合的 K_D 為 3.9 和 2.8 μM (如圖 3C)。

 

 

圖 3. BacPROTAC-1 對(duì)枯草芽孢桿菌 ClpCP 的體外重編程^[6]

 

由于磷精氨酸的化學(xué)穩(wěn)定性等方面存在問(wèn)題，在體內(nèi)的應(yīng)用有限。作者團(tuán)隊(duì)將內(nèi)源性的磷酸化精氨酸殘基 (pArg) 換成了高選擇性的 sCym-1。sCym-1 不但可以和枯草芽孢桿菌的 ClpCP 結(jié)合，還可以與分歧桿菌的 ClpC1P1P2 結(jié)合。

 

 

 
由于細(xì)胞生物素會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性與 mSA 結(jié)合，一定程度上阻礙 BacPROTAC 活性 (圖 5)，作者團(tuán)隊(duì)確定以 Bromodomain-1 (BD1) 作為更吸引人的模型底物，并將 JQ1 作為新的POI配體，天然環(huán)素 dCymM  作為 ClpC_NTD 結(jié)合基團(tuán)。BacPROTACs 以濃度依賴性的方式促進(jìn) BRDT_BD1 的降解。
 

圖 5. BacPROTACs 可以對(duì)分枝桿菌 ClpC1P1P2 進(jìn)行重編程^[6]

上：BRDTBD1-directed BacPROTACs: 通過(guò)不同的 Linker 和連接位點(diǎn)連接 JQ1 到dCymM。下：分枝桿菌 ClpC1P1P2 與 BD1 孵育后降解的 SDS-PAGE 分析。

 

總之，如圖 6 所示：PROTACs 通過(guò)招募 E3 連接酶來(lái)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)降解，E3 連接酶使得靶蛋白貼上泛素化標(biāo)簽，最后蛋白酶體降解泛素化的蛋白質(zhì)。

BacPROTACs 以高度特異的方式將細(xì)菌 ClpCP 蛋白酶定向到底物上，它不但可以誘導(dǎo)底物和蛋白酶之間的接近，并且通過(guò)結(jié)合誘導(dǎo)無(wú)活性的 ClpCP 十聚體重組為有活性的六聚體形式，直接啟動(dòng) ClpCP 水解靶標(biāo)蛋白。

 

圖 6. 蛋白質(zhì)降解的異雙功能方法^[5]

   

在降解劑分類(lèi)里，分子膠 (Molecular glues) 指同樣發(fā)揮誘導(dǎo)蛋白降解作用卻無(wú) Linker 連接的一類(lèi)分子，如Thalidomide、CC-92480、CC-90009 等結(jié)構(gòu)。分子膠在結(jié)構(gòu)上更接近傳統(tǒng)小分子,在膜透過(guò)性和生物利用度上更具優(yōu)勢(shì)，是 PROTAC 型降解劑的一個(gè)改造方向。

 

 

 

降解劑的最終目的是降解相關(guān)的蛋白， 無(wú)論是依賴泛素酶途徑的 PROTAC，依賴蛋白酶體途徑的 LYTAC，依賴 (ClpCP) 蛋白酶的 BacPROTAC。除 Kd 值測(cè)定之外，Western Blot 實(shí)驗(yàn)在驗(yàn)證蛋白降解方面更為直觀，因此常常被用于 PROTAC 類(lèi)分子活性的測(cè)試。

 

 

 
PROTAC 已經(jīng)衍生出一類(lèi) “POI 配體-Linker-降解系統(tǒng)導(dǎo)向物” 模式的分子，這類(lèi)分子補(bǔ)足了 PROTAC 作為降解劑在某些蛋白與非蛋白分子降解上的不足，賦予了降解劑這一概念更多的可能性。除了分子自身作用機(jī)制帶來(lái)活性測(cè)試結(jié)果上與常規(guī)分子的差異，合適的降解途徑對(duì)活性的影響尤其巨大。 
 
MCE 是全球領(lǐng)先的科研化學(xué)品和生物活性化合物供應(yīng)商，可以為科學(xué)家提供 PROTAC 類(lèi)相關(guān)產(chǎn)品，目前我們已有 PROTAC、AUTAC、ATTEC、分子膠以及它們的構(gòu)成模塊等各種產(chǎn)品在線。同時(shí)，我們還提供 PROTAC 類(lèi)產(chǎn)品的一體化合成服務(wù)。
 

ATTEC

LC3-mHTT-IN-AN2 LC3-mHTT-IN-AN2 (Compound AN2) 是一種 mHTT-LC3 連接化合物，LC3-mHTT-IN-AN2 與突變型亨廷頓蛋白 (mHTT) 和 LC3B 相互作用，但不與 wtHTT 或無(wú)關(guān)的對(duì)照蛋白相互作用。LC3-mHTT-IN-AN2 以等位基因選擇性的方式降低了亨廷頓病 (HD) 小鼠神經(jīng)元中mHTT水平。

LC3-mHTT-IN-AN1 LC3-mHTT-IN-AN1 (Compound AN1) 是一種 mHTT-LC3 連接化合物，LC3-mHTT-IN-AN1 與突變型亨廷頓蛋白 (mHTT) 和 LC3B 相互作用，但不與 wtHTT 或無(wú)關(guān)的對(duì)照蛋白相互作用。LC3-mHTT-IN-AN1 以等位基因選擇性的方式降低了亨廷頓病 (HD) 小鼠神經(jīng)元中mHTT水平。

AUTAC

AUTAC1 AUTAC1是一種 MetAP2 靶向自噬介導(dǎo)降解體 (AUTAC)。AUTACs 包含一個(gè)降解標(biāo)簽和一個(gè)彈頭確保靶向特異性。AUTAC1 包含一個(gè) FBnG 和一個(gè) Fumagillol 部分。Fumagillol 共價(jià)結(jié)合到 MetAP2 上。

AUTAC2 AUTAC2 是一種 FKBP12 靶向自噬介導(dǎo)降解體 (AUTAC)。AUTAC2 包含一個(gè) FBnG 和 SLF 部分，其中 SLF 與FKBP12 非共價(jià)結(jié)合。

Molecular Glues

Mezigdomide Mezigdomide (CC-92480) 是一種 cereblon E3 泛素連接酶調(diào)節(jié)藥物 (CELMoD)，以分子膠的方式作用。Mezigdomide 與 cereblon 有較強(qiáng)的親和力，具有抗骨髓瘤活性。

Eragidomide Eragidomide (CC-90009) 是首創(chuàng)的 GSPT1 選擇性 cereblon (CRBN) E3 連接酶調(diào)節(jié)劑，以分子膠的方式作用。Eragidomide 通過(guò) CRL4CRBN 選擇性靶向 GSPT1 進(jìn)行泛素化和蛋白酶體降解。

FPFT-2216 FPFT-2216 是一種“分子膠”化合物，可降解磷酸二酯酶 6D (PDE6D)、鋅指轉(zhuǎn)錄因子 Ikaros (IKZF1)、Aiolos (IKZF3) 和酪蛋白激酶 1α (CK1α)。FPFT-2216 可用于癌癥和炎癥疾病的研究。

 
MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報(bào)，我們不為任何個(gè)人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)。

 

參考文獻(xiàn)

1. Jin J, Wu Y, Chen J, Shen Y, Zhang L, Zhang H, Chen L, Yuan H, Chen H, Zhang W, Luan X. The peptide PROTAC modality: a novel strategy for targeted protein ubiquitination. Theranostics. 2020 Aug 8;10(22):10141-10153.

2. Fischer F, Alves Avelar LA, Murray L, Kurz T. Designing HDAC-PROTACs: lessons learned so far. Future Med Chem. 2022 Jan;14(3):143-166.

3. Pettersson M, Crews CM. PROteolysis TArgeting Chimeras (PROTACs) - Past, present and future. Drug Discov Today Technol. 2019 Apr;31:15-27.

4. Ahn G, Banik SM, Miller CL, Riley NM, Cochran JR, Bertozzi CR. LYTACs that engage the asialoglycoprotein receptor for targeted protein degradation. Nat Chem Biol. 2021 Sep;17(9):937-946.

5. Fu Y, Lu B. Targeting lipid droplets for autophagic degradation by ATTEC. Autophagy. 2021 Dec;17(12):4486-4488.

6. Morreale FE, Kleine S, Leodolter J, Junker S, Hoi DM, Ovchinnikov S, Okun A, Kley J, Kurzbauer R, Junk L, Guha S, Podlesainski D, Kazmaier U, Boehmelt G, Weinstabl H, Rumpel K, Schmiedel VM, Hartl M, Haselbach D, Meinhart A, Kaiser M, Clausen T. BacPROTACs mediate targeted protein degradation in bacteria. Cell. 2022 Jun 1:S0092-8674(22)00593-1.

7. Schreiber SL. The Rise of Molecular Glues. Cell. 2021 Jan; 184(1): 3-9.

8. Li Z, Wang C, Wang Z, Zhu C, Li J, Sha T, Ma L, Gao C, Yang Y, Sun Y, Wang J, Sun X, Lu C, Difiglia M, Mei Y, Ding C, Luo S, Dang Y, Ding Y, Fei Y, Lu B. Allele-selective lowering of mutant HTT protein by HTT-LC3 linker compounds. Nature. 2019 Nov;575(7781):203-209.

9. Grohmann, C., Magtoto, C.M., Walker, J.R. et al. Development of NanoLuc-targeting protein degraders and a universal reporter system to benchmark tag-targeted degradation platforms. Nat Commun. 2022 Apr; 13:2073.