一、相關(guān)背景
基因治療是指用正常的基因?qū)�入人體細胞，以糾正或補充基因缺陷和異常所引起的疾病，是一種治療遺傳病的根本性策略。歷經(jīng)30年的艱難發(fā)展，基因治療已成為治療人類各種遺傳性疾病的關(guān)鍵手段。腺相關(guān)病毒（AAV）因其能夠感染廣泛的組織且具有較低的免疫原性和較低的整合能力，被認為具有較好的安全性，因而AAV成為在體基因治療領(lǐng)域最前沿、最有潛力和最常用的病毒載體之一。世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《世界視力報告》指出，在全球范圍內(nèi)，至少有22億人患有視力障礙或失明，至少有10億人是可以預(yù)防和治療的。

眼睛由于體積小，較小劑量的AAV載體即可實現(xiàn)穩(wěn)健轉(zhuǎn)導(dǎo)，由于血視網(wǎng)膜屏障的存在，相對封閉，具備免疫赦免特性，局部給藥安全性相對較高，且眼底疾病多為單基因遺傳疾病，因此眼部成為基因治療中非常熱門的器官。

目前眼科基因治療的適應(yīng)癥主要是與單個基因突變相關(guān)的遺傳性視網(wǎng)膜疾病（Inherited Retinal Diseases, IRDs），包括視網(wǎng)膜色素變性、無脈絡(luò)膜癥、Leber遺傳性視神經(jīng)病變（LHON）、Leber先天性黑蒙（LCA）、Stargardt病、色盲癥（ACHM）、X連鎖視網(wǎng)膜劈裂癥（XLRS）和年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD）等，這些患者的獨立生活和日常活動能力受到極大損害，具有極大的醫(yī)療需求。因而針對眼部的基因治療研究一直處于基因治療研究的前沿，是AAV基因治療的黃金賽道，占據(jù)AAV基因治療臨床試驗四分之一。

圖1 導(dǎo)致視網(wǎng)膜疾病的相關(guān)基因^[2]

二、血清型選擇和注射方式
目前已開展的眼科AAV基因治療臨床試驗中靶向眼底的各種細胞類型有很多，如視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)、神經(jīng)節(jié)細胞層和感光細胞層。試驗使用的載體以AAV2、5、8血清型居多，但近幾年使用較多的改造載體如AAV2-7M8、AAV2-tYF、scAAV等，已被用于臨床研究。

根據(jù)治療目的不同，AAV載體介導(dǎo)的眼部基因轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要有玻璃體腔注射、視網(wǎng)膜下腔注射、前房注射、結(jié)膜下注射等，其中比較常用的是玻璃體腔注射和視網(wǎng)膜下腔注射。在多種動物模型中，研究表明AAV載體玻璃體腔注射主要感染神經(jīng)節(jié)細胞，此種注射方法會產(chǎn)生針對AAV衣殼蛋白的體液免疫反應(yīng)，引起眼內(nèi)炎癥。視網(wǎng)膜下注射主要感染視網(wǎng)膜色素上皮細胞和光感受器細胞，不會觸發(fā)體液免疫反應(yīng)，但要注意避免注射造成的出血損傷以及潛在的視網(wǎng)膜脫離的風(fēng)險。

三、示例展示
本文中將對眼部常用注射方法予以詳細介紹，供大家在注射方法選擇及操作時參考。

1.前房注射
前房是角膜和虹膜之間的腔隙，為房水所充盈。小鼠巨大的晶狀體向前房隆起，小鼠的前房相對比人體的要淺得多。小鼠前房注射液體或氣體可以提高眼內(nèi)壓，是制作青光眼模型的方法之一。具體操作步驟如下：

▶ 實驗前準備
麻醉小鼠：在小鼠稱重后，經(jīng)腹腔注射適量的1%戊巴比妥鈉溶液，放置于飼養(yǎng)籠內(nèi)，等待麻醉約5-10min。小鼠麻倒后，眼球表面滴入擴瞳劑使其散瞳。

▶ 前房注射
用微量注射器吸取適量病毒備用，取麻醉后的小鼠置于操作臺上，眼部給予鹽酸利多卡因進行局部麻醉，左手按住頭部，使其眼球部分突出，右手持微量注射器從虹膜上1-2mm處插入前房，針尖平行進入，隨后快速推注病毒，形成空氣，使氣泡正好在針頭上，堵住針口，防止漏液。病毒注射完畢，緩慢抽出針頭。

▶ 動物復(fù)蘇
將小鼠放回飼養(yǎng)籠內(nèi)，注意保溫，待其蘇醒。

2.玻璃體腔注射
▶ 實驗前準備
麻醉小鼠：在小鼠稱重后，經(jīng)腹腔注射適量的1%戊巴比妥鈉溶液，放置于飼養(yǎng)籠內(nèi)，等待麻醉約5-10min。小鼠麻倒后，眼球表面滴入擴瞳劑使其散瞳。

▶ 玻璃體腔注射
用微量注射器吸取適量病毒備用，取麻醉后的小鼠置于操作臺上，眼部給予鹽酸利多卡因進行局部麻醉，左手按住頭部，使其眼球部分突出，右手持微量注射器自角膜后緣1mm位置插入玻璃體腔內(nèi)，針尖先垂直進入，隨后傾斜，慢慢推注病毒。病毒注射完畢，緩慢抽出針頭。

▶ 動物復(fù)蘇
將小鼠放回飼養(yǎng)籠內(nèi)，注意保溫，待其蘇醒。

圖3 玻璃體注射

3.視網(wǎng)膜下注射
小鼠的后半眼球壁由內(nèi)向外分為視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜和鞏膜。小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)與人體類似（圖4），注射具體操作步驟如下：
 

圖4 C57BL小鼠視網(wǎng)膜組織HE染色圖（400×）
 

▶ 實驗前準備
麻醉小鼠：在小鼠稱重后，經(jīng)腹腔注射適量的1%戊巴比妥鈉溶液，放置于飼養(yǎng)籠內(nèi)，等待麻醉約5-10min。小鼠麻倒后，眼球表面滴入擴瞳劑使其散瞳。

▶ 病毒注射
用微量注射器吸取適量病毒備用，取麻醉后的小鼠置于操作臺上，眼部給予鹽酸利多卡因進行局部麻醉，左手按住頭部，使其眼球部分突出，右手持微量注射器自角膜后緣1mm位置插入玻璃體腔，針尖先垂直進入，隨后傾斜，直至對側(cè)視網(wǎng)膜（經(jīng)玻璃體腔注射），有阻力時停止進針，慢慢推注病毒�；蛘哂米⑸淦麽橆^與眼軸呈15°角在動物暴露出的距角膜緣1-2mm處鞏膜開一個扎破鞏膜但不穿透RPE的通道，針頭斜面沒入即停止進針（經(jīng)鞏膜注射），慢慢推注病毒。病毒注射完畢，緩慢抽出針頭。

▶ 動物復(fù)蘇
將小鼠放回飼養(yǎng)籠內(nèi)，注意保溫，待其蘇醒。

4.結(jié)膜下注射
結(jié)膜下注射是眼局部給藥的常用方法。具體操作步驟如下

▶ 實驗前準備
麻醉小鼠，等待約5-10min，滴入擴瞳劑。

▶ 病毒注射
用微量注射器吸取適量病毒備用，取麻醉后的小鼠置于操作臺上，眼部給予鹽酸利多卡因進行局部麻醉，用鑷子夾起結(jié)膜，沿結(jié)膜內(nèi)側(cè)刺入3-4mm，可透過結(jié)膜觀察到針頭的走向，慢慢注射病毒，注射完畢，停留數(shù)秒拔針，注射后可見球結(jié)膜下有隆起，眼球突出。

▶ 動物復(fù)蘇
將小鼠放回飼養(yǎng)籠內(nèi)，注意保溫，待其蘇醒。
 

圖6 結(jié)膜下注射

參考文獻：
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