背景：限制光學(xué)成像進(jìn)入深層生物組織的因素之一是吸水率；由于O-H鍵彎曲的振動泛音模式，水在1,445nm處出現(xiàn)了一個局部吸收峰。在800-1400nm范圍內(nèi)，光吸收相對較低，大腦等組織的成像受散射影響為主，可以在厘米深度成像，但由于光散射，分辨率會損失。水的吸光度和光散射都會影響NIR-IIb窗口(1500-1700nm)的成像。在1700nm以上，光散射進(jìn)一步減少，但對水的吸光度增加。到目前為止，還沒有關(guān)于波長大于1700nm的單光子激發(fā)熒光成像生命系統(tǒng)的報道，由于缺乏具有足夠的量子產(chǎn)量/亮度的生物相容性熒光探針，而且InGaAs相機對NIR-IIc/NIR-IId范圍內(nèi)波長大于1700nm的光不敏感。

實驗內(nèi)容：作者合成了發(fā)射峰在2009nm的硫化鉛量子點。然后通過陽離子交換方法在硫化鉛核上生長一個硫化鎘殼，以保護(hù)硫化鉛核不被降解。這使核心的發(fā)射峰位移到1880nm。為了將QDc從有機相轉(zhuǎn)移到水相，作者將親水聚合物交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)(P3涂層)涂層在QDc上，使其在生理環(huán)境中具有生物相容性，通過膽道排泄，沒有明顯的毒性。最終P3-QDc在NIR-IIc中的峰值發(fā)射波長為1820nm。可檢測1550~2000nm波長的探測器SNSPD也克服了InGaAs探測器1700nm的檢測限制。
 

作者首先成像充滿水懸浮液的50-μm直徑毛細(xì)管，使用發(fā)射峰值在NIR-IIb的P3-QDb或NIR-IIc的P3-QDc，浸在5%脂質(zhì)溶液內(nèi)，模擬小鼠腦組織的血管。SNSPD的SBR，分辨率比InGaAs相機高，NIR-IIc的波長下, SNSPD可以實現(xiàn)更深深度的成像，1650nm激發(fā)下，可在4.4mm下分辨毛細(xì)管，比1540nm激發(fā)NIR-IIc成像和1319nm激發(fā)NIR-IIb成像更深。（圖2a-c）1900nm以上的熒光信號隨著水層的增加而減少，說明水對熒光吸收的影響。（圖2d）
 

圖2
 

作者通過完整的小鼠頭部進(jìn)行了血管的NIR-IIc無創(chuàng)三維共聚焦成像，解決了三維的老鼠頭部層成像(圖3b)。觀察到通過腦膜連接顱骨和大腦皮質(zhì)的血管狀通道。這些通道被證明對大腦對損傷和感染的免疫反應(yīng)是重要的。作者比較了SNSPD與商業(yè)光電倍增管(PMT)，相對于PMT，SNSPD的SBR和成像深度都更高。對于1319nm激光激發(fā)下的NIR-IIb成像，基于SNSPD的共聚焦顯微鏡分辨了PMT未檢測到的小毛細(xì)血管，并在更大的成像深度下允許更高的空間分辨率(圖3c，第一柱和第二柱；圖3d)。在1540nm的激光激發(fā)下，使用SNSPD在NIR-IIc窗口的成像比在1319nm的NIR-IIb區(qū)域分辨率更好。比較1650nm和1540nm激光進(jìn)行NIR-IIc成像；1650nm激發(fā)下FWHM量化的空間分辨率明顯提高(圖3c，第三柱和第四柱；圖3d，e)。只有1650nm激光激發(fā)的NIR-IIc成像允許在超過1,100μm的深度成像小鼠頭部，而且對比度最高（圖3d,e）。
 

圖3

 

作者通過完整的小鼠皮膚對淋巴結(jié)進(jìn)行了成像，這與以前通過侵入性手術(shù)安裝透明窗口的活體顯微鏡檢查法不同。首先對小鼠腹股溝淋巴結(jié)中HEV上的PNAd進(jìn)行無創(chuàng)體內(nèi)NIR-IIc分子成像。將結(jié)合了P3-QDc的抗MECA-79抗體(aMECA-79-QDc)注射到小鼠體內(nèi)，24小時后注射有機探針p-FE（NIR-IIb區(qū)成像血管）。在NIR-IIb和NIR-IIc中進(jìn)行InGaAs寬視場成像和SNSPD共聚焦顯微鏡成像，觀察到aMECA-79-QDc的發(fā)射以及標(biāo)記的血管(圖4b,c)，明顯看到SNSPD的背景信號更低。而注射沒有無偶聯(lián)aMECA-79的P3-QDc的對照組小鼠的淋巴結(jié)中未檢測到QDc發(fā)射信號。高分辨率三維共聚焦成像中，只有HEV被aMECA-79-QDc標(biāo)記，說明了aMECA-79-QDc的靶向性(圖4d)。P3-QDc和aMECA-79-QDc的穩(wěn)定性允許在4天內(nèi)對淋巴結(jié)中HEV成像(圖4e)。
 

圖4a-e

 

為了實現(xiàn)細(xì)胞分辨率的體內(nèi)無創(chuàng)NIR-IIc共聚焦顯微鏡成像，對完整小鼠淋巴結(jié)中的CD169（巨噬細(xì)胞表達(dá)）和CD3（T細(xì)胞表達(dá)）進(jìn)行雙色分子成像。作者將CD169抗體結(jié)合到QDs(aCD169-QDa)，CD3抗體結(jié)合到P3-QDc(aCD3-QDc)。注射后1天，寬視場圖像顯示淋巴結(jié)中存在較強的aCD169-QDa和aCD3-QDc信號(圖4f)。雙色大面積共聚焦顯微鏡顯示，被aCD169-QDa標(biāo)記的CD169+巨噬細(xì)胞勾畫出包膜下竇；由aCD3-QDc標(biāo)記的CD3+T細(xì)胞位于淋巴結(jié)內(nèi)部的T細(xì)胞區(qū)(圖4g，h)。未標(biāo)記的B細(xì)胞濾泡也可以被識別出來(圖4h中的黑暗區(qū)域)，因為它們靠近巨噬細(xì)胞層，并被T細(xì)胞包圍。500μm深度下仍可以看到CD3+T細(xì)胞在1,650nm激發(fā)下標(biāo)記在細(xì)胞的外部(圖4i)。在體外，用DRAQ7染料對細(xì)胞核進(jìn)行染色。DRAQ7和aCD3-QDc在體外共聚焦下可清晰分辨細(xì)胞被aCD3-QDc勾畫出來(圖4j)。這些結(jié)果建立了體內(nèi)完整淋巴結(jié)下細(xì)胞分辨的無創(chuàng)NIR-IIc共聚焦顯微鏡成像。
 

圖4f-j

 

總結(jié)：作者開發(fā)了發(fā)射峰超過1700nm（NIR-IIc）的量子點探針和可探測1700nm以上信號的探測器SNSPD，增加了近紅外成像的穿透深度，可通過完整的小鼠頭部成像腦膜下的腦血管，可分辨淋巴結(jié)內(nèi)的T細(xì)胞和吞噬細(xì)胞。

參考文獻(xiàn)

https://doi.org/10.1038/s41565-022-01130-3

 

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