檀香烯是倍半萜類具有代表性的化合物之一，也是檀香精油的主要成分，在醫(yī)藥、食品、香料等領域有著重要的應用。由于天然檀香資源十分有限，且難以獲得，合成生物學方法利用微生物細胞工廠大規(guī)模生產(chǎn)檀香烯成為解決這一難題的新思路。Establishing Komagataella phaffii as a Cell Factory for Efficient Production of Sesquiterpenoid α-Santalene浙江大學連佳長課題組首次利用畢赤酵母細胞工廠高效合成倍半萜類化合物α-檀香烯。
研究通過優(yōu)化啟動子，促進了α-檀香烯合成酶基因（SAS） 表達、甲羥戊酸（MVA）途徑關鍵基因的過表達，以及SAS多拷貝整合構建工程菌株。結合培養(yǎng)基和生物工藝優(yōu)化，后的工程菌株（STE-9）能夠在搖瓶、分批發(fā)酵和補料分批發(fā)酵中分別生產(chǎn)滴度高達829.8 ± 70.6 mg/L，4.4 ± 0.3 g/L和21.5 ± 1.6 g/L的檀香烯。  
構建產(chǎn)α-檀香烯畢赤酵母株
首先實驗將密碼子優(yōu)化的α-檀香烯合成酶基因（SAS）引入畢赤酵母中使其能夠生產(chǎn)α-檀香烯。在一系列組成型啟動子和甲醇誘導型啟動子中，TEF1p菌株（STE-1）的α-檀香烯產(chǎn)量更高。以釀酒酵母工程菌株對照進行發(fā)酵實驗，證明畢赤酵母在表達外源基因和合成萜類化合物方面具有優(yōu)勢。
MVA途徑基因過表達和SAS多拷貝整合提高產(chǎn)量
提高MVA途徑的代謝通量是提高萜類化合物產(chǎn)量的有效策略。將tHMG1和IDI1-ERG20整合到STE-1的基因組中，分別獲得工程菌STE-3和STE-5。同時過表達tHMG1和IDI1-ERG20（STE-6）使α-檀香烯的產(chǎn)量增加到246.9 ± 33.8 mg/L，約為STE-1的2.74倍。由于乙酰輔酶A是MVA途徑的直接前體，乙酰輔酶A合成酶基因（ACS*）的過表達使α-檀香烯的產(chǎn)量進一步提高到282.4 ± 44.1 mg/L。

為了進一步提高α-檀香烯的產(chǎn)量，構建了含有SAS多拷貝的畢赤酵母工程菌。將SAS的額外拷貝整合到STE-1、STE-3和STE-7中，獲得工程菌STE-2、STE-4和STE-8，α-檀香烯產(chǎn)量分別是其單拷貝菌株的1.9倍、1.55倍和1.56倍。隨著SAS拷貝數(shù)的增加，發(fā)現(xiàn)3個拷貝SAS的菌株更為適宜。
 
培養(yǎng)基優(yōu)化提高產(chǎn)量
進一步通過培養(yǎng)基組分優(yōu)化提高產(chǎn)物產(chǎn)量。選擇4種不同的蛋白胨測試對α-檀香烯生物合成的影響。搖瓶發(fā)酵YP1D組α-檀香烯產(chǎn)量更高，達829.8 ± 70.6 mg/L。YP1D為更適合的培養(yǎng)基組分。
T&J-MInibox 平行生物反應器發(fā)酵提高產(chǎn)量
將優(yōu)化后的工程菌株STE-9用于1-L發(fā)酵罐（MInibox，迪必爾生物工程（上海）有限公司）的分批和補料分批發(fā)酵對照研究，以便選擇更合適的培養(yǎng)策略。補料分批發(fā)酵種，種子被接種至含有600 mL YP1D培養(yǎng)基的發(fā)酵罐。發(fā)酵溫度控制在30°C，DO 100%，罐體壓力保持在0.8個大氣壓。24 h后，發(fā)酵罐中加入10%（v/v）正十二烷。當葡萄糖濃度減少至1 g/L時，進行恒速補料，攪拌速率維持在200-800 rpm，DO約20%。在發(fā)酵后期對pH進行調節(jié)，并定期測定OD600、葡萄糖濃度、乙醇濃度和產(chǎn)物濃度。
在分批發(fā)酵罐中，α-檀香烯的產(chǎn)量為4.4 ± 0.3 g/L，而在補料分批發(fā)酵罐中，α-檀香烯的產(chǎn)量高達到21.5 ± 1.6 g/L。補料分批發(fā)酵顯著提高產(chǎn)量。該研究利用迪必爾生物反應器成功打破了目前為止報道的α-檀香烯的合成紀錄，證明了合成生物學方法利用畢赤酵母細胞工廠在生產(chǎn)萜類化合物和其他天然珍貴產(chǎn)物上的優(yōu)勢。

參考文獻：
1、Zuo Y, Xiao F, Gao J, Ye C, Jiang L, Dong C, Lian J. Establishing Komagataella phaffii as a Cell Factory for Efficient Production of Sesquiterpenoid α-Santalene. J Agric Food Chem. 2022 Jun 21. doi: 10.1021/acs.jafc.2c02353. Epub ahead of print. PMID: 35729733.
2、https://mp.weixin.qq.com/s/QHQERgNHVE5LHtkULgkvHA