癌細(xì)胞體外培養(yǎng)方法
生物反應(yīng)器的低剪切應(yīng)力動態(tài)培養(yǎng)測試完成后。



1. 選擇非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC) 細(xì)胞系 Calu-3，并將動態(tài)培養(yǎng)的結(jié)果與靜態(tài)懸浮培養(yǎng)對照進(jìn)行比較。具體而言，細(xì)胞在添加了 10% 胎牛血清 (FBS)、1% 青霉素/鏈霉素 (P/S) 和 1% 非必需品的完全培養(yǎng)基 (DMEM) 中生長氨基酸 (NEAA, Sigma )，并在 37°C 和 5% CO 2的水飽和氣氛中維持在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)條件下在空氣中。

2. 在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中擴(kuò)增后，將 9x10 6 Calu-3 細(xì)胞 (1.92x10 ⁵細(xì)胞/mL) 接種在生物反應(yīng)器培養(yǎng)室內(nèi)，并在具有完全生長培養(yǎng)基的動態(tài)懸浮液中培養(yǎng) 5 天。

3. 生物反應(yīng)器以 5 mL/min 的流速運(yùn)行。同時，Calu-3 細(xì)胞以相同的密度接種在用作對照的低附著培養(yǎng)瓶（Corning Inc）上，代表靜態(tài)懸浮培養(yǎng)模型。

4. 五天后，分別從生物反應(yīng)器和低附著培養(yǎng)瓶中取出動態(tài)和靜態(tài)懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，并重新懸浮在新鮮的生長培養(yǎng)基中進(jìn)行進(jìn)一步分析。進(jìn)行三個獨(dú)立的靜態(tài)和動態(tài)懸浮培養(yǎng)。
 
細(xì)胞體外培養(yǎng)的 驗證
通過倒置顯微鏡（Olympus ）研究從生物反應(yīng)器和低附著培養(yǎng)瓶中收獲并重新懸浮在新鮮生長培養(yǎng)基中的 Calu-3 細(xì)胞。

通過細(xì)胞掃描儀和圖像分析軟件收集和分析顯微照片，以便  計算單個 Calu-3 細(xì)胞的數(shù)量和形成球體的 Calu-3 細(xì)胞的數(shù)量，以及確定球體尺寸。

細(xì)胞的TEM分析
對來自動態(tài)和靜態(tài)懸浮培養(yǎng)物的 Calu-3 細(xì)胞進(jìn)行了處理，用于透射電子顯微鏡 (TEM) 分析和免疫細(xì)胞化學(xué)。

TEM 分析步驟如下：將 Calu-3 細(xì)胞固定在 Karnovsky 溶液（4% 甲醛、5% 戊二醛）中。樣品在 1% 四氧化鋨中后固定，并通過增加酒精濃度進(jìn)行脫水。然后，用環(huán)氧丙烷洗滌樣品并嵌入環(huán)氧樹脂中。用亞甲藍(lán)和番紅對 0.5 μm 厚的切片進(jìn)行染色，以從形態(tài)上選擇感興趣的區(qū)域。隨后，在 300 目銅網(wǎng)格上收集超薄切片，用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后，在 TEM下進(jìn)行定性檢查。

驗證活躍細(xì)胞周期中的細(xì)胞比例
用抗 Ki67）和抗 γ 組蛋白 H2AX抗體染色細(xì)胞斑點(diǎn)，并用 DAB（3,3'-二氨基聯(lián)苯胺）顯示過氧化物酶 (HRP) 底物試劑盒反應(yīng)。Ki67 和 γH2AX 陽性細(xì)胞分?jǐn)?shù)的定量驗證是通過計算每個分析樣品上計數(shù)的總共 900-2000 個細(xì)胞核中的陽性細(xì)胞核數(shù)來進(jìn)行的。使用細(xì)胞凋亡試劑盒研究單細(xì)胞水平的凋亡細(xì)胞死亡。使用Olympus BX60或明美顯微鏡測量綠色核熒光陽性。4',6-二脒-2-苯炔醇 。通過計算總共近 1000 個細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞核的數(shù)量來驗證死細(xì)胞的比例。使用單向方差分析測試分析數(shù)據(jù)。當(dāng) p<0.05 時，結(jié)果被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

研究在生物反應(yīng)器內(nèi)動態(tài)培養(yǎng) 
5天后細(xì)胞/球體可能意外粘附在過濾器上，過濾器用4%多聚甲醛固定，在室溫下與DAPI一起孵育15分鐘，依次用熒光顯微鏡觀察驗證其表面是否存在核。
 
驗證培養(yǎng)室下部是否存在粘附的 Calu-3 細(xì)胞和沉淀
細(xì)胞體外培養(yǎng)收獲時，用細(xì)胞刮刀刮擦培養(yǎng)室的內(nèi)壁，并用磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS) 洗滌。因此將PBS收集在培養(yǎng)皿中并通過倒置顯微鏡觀察以檢測Calu-3細(xì)胞的存在。

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