據(jù)統(tǒng)計，當(dāng)今世界約有8億精神疾病患者，而這一數(shù)字還在持續(xù)增長。精神疾病的癥狀嚴(yán)重影響著病人的生活，致使他們經(jīng)常被污名化，他們的自殺風(fēng)險估計至少比普通公眾高十倍。

對于科學(xué)家來說，精神疾病的異質(zhì)性也給研究帶來了不小的挑戰(zhàn)：具有相同診斷的患者在癥狀、治療藥物和基因方面表現(xiàn)出極大的差異。因此，深入了解這些疾病的細(xì)胞和分子結(jié)構(gòu)不僅對理解該疾病至關(guān)重要，而且對它們的發(fā)展和治療也至關(guān)重要。

本期推送為大家?guī)�來一篇關(guān)于精神分裂癥（Scz）的研究論文，該研究利用單細(xì)胞測序等技術(shù)深入研究了Scz的神經(jīng)發(fā)育途徑。

基本信息

文章題目：Schizophrenia is defined by cell-specific neuropathology and multiple neurodevelopmental mechanisms in patient-derived cerebral organoids

發(fā)表時間：2022年3月

發(fā)表期刊：MOL PSYCHIATR（IF=15.992）

關(guān)鍵詞：神經(jīng)分裂癥，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)，蛋白質(zhì)組學(xué)

研究方法：高通量流式細(xì)胞術(shù)，液相色譜-質(zhì)譜（LC/MS），scRNA-seq，激光掃描共焦顯微鏡

發(fā)表單位：美國康奈爾大學(xué)醫(yī)學(xué)院

文章摘要 

研究利用患者源性誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）生成3D類腦器官來模擬在這一關(guān)鍵時期精神分裂癥（Scz）的神經(jīng)病理學(xué)。

研究者發(fā)現(xiàn)Scz類器官表現(xiàn)出腦室神經(jīng)病理學(xué)，導(dǎo)致祖細(xì)胞存活率改變和神經(jīng)發(fā)生中斷。這最終在Scz類器官發(fā)育的皮質(zhì)區(qū)內(nèi)產(chǎn)生較少的神經(jīng)元。單細(xì)胞測序顯示，Scz祖細(xì)胞特異性缺乏神經(jīng)元編程因子，導(dǎo)致細(xì)胞譜系重塑、分化軌跡改變和皮質(zhì)細(xì)胞類型多樣性扭曲。雖然Scz類器官的大分子多樣性與健康對照（CTRL）產(chǎn)生的類器官相似，但四種GWAS因子（PTN、COMT、PLCL1和PODXL）和屬于POU域轉(zhuǎn)錄因子家族的肽片段（例如POU3F2/BRN2）發(fā)生了改變。這表明，Scz類器官的主要差異不在于其蛋白質(zhì)組多樣性，而在于其在分子水平上的疾病總量和神經(jīng)發(fā)育因子。隨后，單細(xì)胞測序確定了神經(jīng)元編程因子的細(xì)胞類型特異性改變以及神經(jīng)營養(yǎng)生長因子表達(dá)的發(fā)育開關(guān)，表明Scz神經(jīng)病理學(xué)可以在細(xì)胞類型的基礎(chǔ)上進(jìn)行編碼。此外，單細(xì)胞測序還特異性復(fù)制了Scz祖細(xì)胞和神經(jīng)元中BRN2（POU3F2）和PTN的缺失。隨后，在兩個挽救實驗中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子BRN2和生長因子PTN分別作為Scz類器官中神經(jīng)發(fā)生和細(xì)胞存活的機(jī)制性底物。

總之，研究表明，Scz的多種機(jī)制存在于患者衍生的類器官中，并且這些不同的機(jī)制集中于原始的大腦發(fā)育途徑，如神經(jīng)元分化、存活和生長因子支持，這些途徑可能合并以提高Scz的內(nèi)在風(fēng)險。

研究結(jié)果 

■患者源性Scz類器官表現(xiàn)出腦室熵和神經(jīng)病理學(xué)特征

首先，研究者采用了一種無形態(tài)因子的類器官方案，可包含感興趣的細(xì)胞類型，同時避免了外源性形態(tài)因子暴露導(dǎo)致的潛在混雜效應(yīng)。因此，從健康對照組和特發(fā)性Scz患者中生成3D大腦類器官。利用免疫組化和激光共聚焦顯微鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)，與對照類器官相似，Scz類器官也表現(xiàn)出廣泛的神經(jīng)誘導(dǎo)，其特征是NESTIN+纖維和SOX2+前體細(xì)胞富集的腦室區(qū)域的存在（圖1b）。然而，Scz比對照的腦室區(qū)域更小，充滿神經(jīng)元的皮質(zhì)區(qū)也更稀疏，表明Scz祖細(xì)胞可能過早死亡或無法啟動神經(jīng)發(fā)生。對iPSC供體的祖細(xì)胞死亡分析發(fā)現(xiàn)Scz腦室祖細(xì)胞死亡顯著增加，且其皮質(zhì)區(qū)內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量顯著減少（圖1c和d）。通過BrdU脈沖追蹤實驗發(fā)現(xiàn)在相同的區(qū)域里，經(jīng)歷神經(jīng)元分化或祖細(xì)胞自我更新的BrdU+增殖祖細(xì)胞的比例。在對照類器官中，祖細(xì)胞在追蹤期間主要分化為早期的神經(jīng)元，而Scz則表現(xiàn)出顯著的神經(jīng)發(fā)生障礙（圖1e）。綜上所述，Scz類器官中的神經(jīng)元丟失是由細(xì)胞凋亡增加和神經(jīng)發(fā)生減少的共同作用引起的。

● 圖1 Scz患者源性類器官中的腦室祖細(xì)胞被破壞

■ 患者源性Scz類器官表現(xiàn)出腦室熵和神經(jīng)病理學(xué)特征

為了繪制3D人衍生類器官的蛋白質(zhì)組，研究采用串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)記（TMT）技術(shù)對從對照和Scz大腦類器官中分離的肽進(jìn)行全局條形碼標(biāo)記，可進(jìn)行定量液相色譜-質(zhì)譜分析（LC-MS）（圖2a）。該方法鑒定了3772個蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，對照和Scz大腦類器官之間的蛋白幾乎完全重疊，只有兩種蛋白是Scz腦類器官所特有的（圖2b）。因此，盡管非定向性大腦類器官的形態(tài)和外觀各不相同，但其大分子組成相對穩(wěn)定且一致。此外，對照和Scz大腦類器官均表現(xiàn)出豐富的神經(jīng)元和大腦發(fā)育途徑。雖然對照和Scz中蛋白質(zhì)的多樣性非常相似，但進(jìn)一步的計算分析表明，Scz中的多肽數(shù)量存在顯著差異。222種蛋白質(zhì)在對照和Scz類器官之間的表達(dá)存在差異（圖2d）。有趣的是，在Scz類器官中鑒定出含有POU結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子的肽片段。結(jié)合前人的Scz基因關(guān)聯(lián)研究，發(fā)現(xiàn)至少約有70種可能的危險蛋白存在與類器官，其中PLCL1、PTN、PODXL和COMT，在Scz類器官中顯著差異表達(dá)（圖2e）。這表明Scz的神經(jīng)病理學(xué)主要與具有既定疾病風(fēng)險的常見分子因素的破壞有關(guān)，這可能是更廣泛的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)共同破壞的結(jié)果。

● 圖2 蛋白質(zhì)組學(xué)和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)鑒定了Scz患者類器官的新疾病特征

■ 單細(xì)胞測序顯示Scz類器官中異常的細(xì)胞類型多樣性

為了更好地觀察SZ中被破壞的特定細(xì)胞類型，研究使用高通量流式細(xì)胞術(shù)及Chromium single cell 3’平臺進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq），以表征皮層細(xì)胞類型的多樣性（圖2f）。與早期的發(fā)現(xiàn)相一致的是，與對照組相比，Scz的神經(jīng)元和祖細(xì)胞豐度減少，然而Scz表現(xiàn)出幾種腦相關(guān)細(xì)胞類型（神經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞、髓樣細(xì)胞等）的異常富集，雖然對照結(jié)果中也有這些細(xì)胞類型但豐度較低。

■ 擬時分析揭示了Scz類器官細(xì)胞譜系的重塑

接下來，研究人員使用scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行擬時分析，來推斷發(fā)育過程細(xì)胞的分化軌跡或細(xì)胞亞型的演化過程（圖3a）。利用這些方法，發(fā)現(xiàn)對照類器官反映了已知神經(jīng)元編程因子的富集，而Scz類器官則由與多能性、細(xì)胞骨架細(xì)絲和神經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)志物定義。在祖細(xì)胞和神經(jīng)元cluster中的異常標(biāo)志物過多，損害了其他原型神經(jīng)元發(fā)育因子和相關(guān)的細(xì)胞類型。擬時序分析結(jié)果表明Scz細(xì)胞譜系重塑，即在類器官里從神經(jīng)元產(chǎn)生中將祖細(xì)胞分化轉(zhuǎn)移出來。

■ SCZ祖細(xì)胞和神經(jīng)元中神經(jīng)病理的細(xì)胞特異性編碼

許多轉(zhuǎn)錄分化調(diào)節(jié)因子在Scz祖細(xì)胞中下調(diào)，包括軸突發(fā)育途徑因子的耗竭（圖3b）。NT-3或NTF3在Scz祖細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。與擬時序分析一致，Scz祖細(xì)胞表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)、細(xì)絲、黏附和血管生成途徑的異常富集，說明這些祖細(xì)胞缺乏一系列促進(jìn)神經(jīng)元分化和促進(jìn)神經(jīng)元早期發(fā)育的因子。在Scz發(fā)育中的神經(jīng)元里，與祖細(xì)胞類似，一些神經(jīng)發(fā)育因子、神經(jīng)絲因子和指導(dǎo)因子的表達(dá)下調(diào)。奇怪的是，研究者發(fā)現(xiàn)Scz神經(jīng)元中PI3K-Akt信號和生長因子結(jié)合途徑的富集，包括TrkA(NTRK1)受體的下調(diào)和神經(jīng)營養(yǎng)素切割因子FURIN的上調(diào)。根據(jù)相互作用模型，Scz神經(jīng)元中上調(diào)的IL6ST可能位于FURIN和TrkA的下游（圖3d）。Scz祖細(xì)胞的NT-3和神經(jīng)元中的TrkA下調(diào)表明可能存在其他神經(jīng)營養(yǎng)因子功能障礙的離散模式。更深層的假設(shè)驅(qū)動分析顯示Scz祖細(xì)胞也傾向于下調(diào)BDNF但上調(diào)NT-4基因的表達(dá)，而TrkB(NTRK2)是祖細(xì)胞中唯一下調(diào)的神經(jīng)營養(yǎng)素受體（圖3e）。與此相反，Scz神經(jīng)元只有TrkA的細(xì)胞特異性下調(diào)。綜上所述，研究者假設(shè)在Scz類器官中，不同的細(xì)胞特異性神經(jīng)病理可能匯聚在共同的通路上，導(dǎo)致祖細(xì)胞和神經(jīng)元之間相關(guān)但不重疊的Scz細(xì)胞特異性神經(jīng)病理。

● 圖3 Scz類器官的細(xì)胞譜系改變和細(xì)胞特異性神經(jīng)病理學(xué)

■ 確定BRN2和PTN為類器官的候選疾病因子

為了確定患者來源的類器官中Scz神經(jīng)病理學(xué)的潛在機(jī)制因素，研究者確定了蛋白質(zhì)組靶點是否可以在scRNA-seq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集中得到驗證。進(jìn)一步對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，研究人員觀察到在Scz樣品中BRN2（增加了胚胎發(fā)育中后期神經(jīng)元的產(chǎn)生）和PTN（靠近GWAS鑒定的Scz相關(guān)位點，也促進(jìn)了細(xì)胞的存活以及其他神經(jīng)發(fā)育過程）的缺失（圖3f和g）。BRN2是一種前腦特異性轉(zhuǎn)錄因子，在哺乳動物腦中的神經(jīng)前體細(xì)胞和遷移神經(jīng)元中表達(dá)，并在早期皮質(zhì)神經(jīng)發(fā)生中發(fā)揮功能作用，可能是Scz神經(jīng)病理的下游病理生理學(xué)底物。BRN2在Scz類器官中的表達(dá)增加導(dǎo)致晚期神經(jīng)元數(shù)量增加，但對祖細(xì)胞死亡沒有影響，說明BRN2參與Scz類器官的神經(jīng)元分化但不參與細(xì)胞凋亡。PTN被認(rèn)為通過促進(jìn)神經(jīng)元分化在早期皮質(zhì)新生中發(fā)揮作用。用PTN處理Scz類器官發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡顯著減少，新生細(xì)胞存活率提高，從而顯著增加神經(jīng)元分化，說明PTN可通過同時促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生和抑制凋亡來調(diào)節(jié)新生細(xì)胞的存活，從而調(diào)節(jié)Scz腦類器官中的神經(jīng)元數(shù)量。利用BrainCloudTM數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步挖掘信息發(fā)現(xiàn)BRN2和PTN在產(chǎn)前人腦發(fā)育期間表現(xiàn)出峰值表達(dá)，說明它們可能是在這一時期與Scz風(fēng)險有關(guān)的胚胎靶點。

總結(jié) 

研究分析了Scz患者來源的3D類器官細(xì)胞特異性神經(jīng)病理和多種機(jī)制，從而揭示了獨特的發(fā)育途徑和新的疾病因素機(jī)制，這些可能導(dǎo)致在早期皮質(zhì)生成中Scz的風(fēng)險。