細(xì)胞凍存技術(shù)

1. 細(xì)胞凍存是將細(xì)胞儲(chǔ)存在低溫環(huán)境中，減少細(xì)胞代謝，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期儲(chǔ)存的一種技術(shù)。

2. 在大多數(shù)細(xì)胞系中，細(xì)胞會(huì)隨著衰老和演化不斷的積累改變，造成表型和基因型的“培養(yǎng)漂移”，在凍存過(guò)程中，適當(dāng)?shù)牟僮骱秃线m的凍存條件可以減少細(xì)胞特性的改變或丟失，起到細(xì)胞保種的作用。因而，正確且成功的凍存對(duì)于細(xì)胞的長(zhǎng)久應(yīng)用起著非常重要的作用。

細(xì)胞凍存原理

1. 當(dāng)溫度低至-70℃時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶活性全部停止，代謝活動(dòng)停止，故實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期保存的目的。

2. 隨著溫度降低，細(xì)胞內(nèi)外的水分都會(huì)結(jié)晶，所形成的冰晶會(huì)造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞，從而引起細(xì)胞死亡，特別是0~-20℃的階段，冰晶呈針狀，及其引發(fā)細(xì)胞損傷。在不加任何保護(hù)劑條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會(huì)形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白變性等，能引起細(xì)胞死亡。

3. 常見(jiàn)的冷凍保護(hù)劑是甘油或二甲基亞砜（DMSO）。DMSO能快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，降低冰點(diǎn)，延緩凍存過(guò)程，同時(shí)增加細(xì)胞膜的通透性，提高細(xì)胞內(nèi)離子濃度，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。
 

 

· 珍貴細(xì)胞保種

· 細(xì)胞株標(biāo)準(zhǔn)品制備

· 臍帶血干細(xì)胞、NK細(xì)胞凍存

細(xì)胞凍存的最佳時(shí)期

1. 用來(lái)凍存的細(xì)胞一般選擇在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，匯合度約 90% 的時(shí)候，這時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)好，細(xì)胞數(shù)量也多，并且在收獲細(xì)胞前 24 小時(shí)換一次培養(yǎng)液。

2. 對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行微生物污染物檢測(cè)，特別是支原體，確保細(xì)胞沒(méi)有任何的污染。在細(xì)胞的收集過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)操作要盡可能的溫和，避免細(xì)胞受損。

細(xì)胞凍存的速率

1. 細(xì)胞的冷凍速率最適控制在讓細(xì)胞有足夠的時(shí)間脫水而又不被過(guò)度脫水導(dǎo)致細(xì)胞損害。對(duì)大多數(shù)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，每分鐘降 1 至 3 ℃是合適的。

2. 梯度降溫法：4℃-30 min，20℃- 2h，-80℃冰箱冷凍過(guò)夜，次日將凍存管轉(zhuǎn)移到液氮罐中長(zhǎng)期保存。

3. 細(xì)胞程序降溫盒，將準(zhǔn)備好的細(xì)胞凍存管放進(jìn)凍存盒，直接在-80℃過(guò)夜后就可以轉(zhuǎn)移至液氮罐中。

4. 在轉(zhuǎn)移存放位置的過(guò)程中一定要迅速，轉(zhuǎn)移時(shí)建議將凍存管放在干冰中恒溫，盡量避免轉(zhuǎn)移過(guò)程因溫度變化對(duì)細(xì)胞活力的影響。

凍存環(huán)境

1. 細(xì)胞也可以在-80℃冰箱保存幾個(gè)月左右的時(shí)間。

2. 細(xì)胞長(zhǎng)期保存溫度是 -130 ℃或更低。

3. 液氮罐中氣態(tài)層溫度在 -140℃至 -180℃之間，細(xì)胞可保存在氣態(tài)層或浸入液氮中，如果可能最好保存在氣態(tài)層，因?yàn)檫@樣可避免由于有液氮進(jìn)入凍存管而在拿出細(xì)胞時(shí)引起爆炸(但是這樣液氮罐內(nèi)只能存儲(chǔ)少量液氮，需要經(jīng)常添加)。

HyCyte™一步凍存液

HyCyte™凍存液是一種即用型、無(wú)血清、無(wú)需程序降溫的細(xì)胞“長(zhǎng)期”凍存液，該產(chǎn)品配方使用已超過(guò)15年，原料均從日本進(jìn)口，凍存品質(zhì)與日本產(chǎn)品一致。

· 安全：無(wú)血清，不含異種動(dòng)物成份

· 高效：復(fù)蘇后細(xì)胞保持高活性及快速增殖  能力，不影響細(xì)胞功能

1.細(xì)胞膜保護(hù)劑—可在細(xì)胞膜外瞬間形成一層保護(hù)膜，保護(hù)細(xì)胞不受細(xì)胞外冰晶的損害。

2. 滲透性保護(hù)劑—可迅速滲透至細(xì)胞內(nèi)部，防止細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生大量冰晶，同時(shí)可保護(hù)細(xì)胞器，減少其在低溫下的損傷。

3. 細(xì)胞沉降穩(wěn)定劑—可平衡細(xì)胞沉降速度，防止細(xì)胞在凍存過(guò)程中聚集成團(tuán)。