做有效的樣品制備不僅能讓咱們事半功倍，節(jié)省實驗時間；同時它還會影響 WB 實驗結(jié)果的準確性，以及實驗的可重復(fù)性。

那么究竟什么樣的蛋白樣品才是成功有效的呢？

有人說：能測出陽性條帶的樣品�。�沒毛病，非常正確�。�

那測出來的條帶有雜帶呢？

那一定是抗體的鍋，反手就是一個投訴！（抗體表示有些委屈 ～）

其實，在 WB 檢測過程中出現(xiàn)非特異性條帶，除了一抗因素，樣品也可能是那個罪魁禍首！

樣品制備環(huán)節(jié)的哪些因素會帶來雜帶呢？小 P 帶大家梳理一下 ～
 

1. 細胞污染

解析：

細胞樣品的交叉污染、分化和傳代次數(shù)過多，都會使蛋白的表達譜發(fā)生變化而出現(xiàn)雜帶。Vimentin 在 MCF-7 中本不表達，但由于以上原因?qū)е?Vimentin 抗體能在 MCF-7 細胞中檢測到條帶（雜帶）。

對策：

1）確保細胞來源，最好有 STR 鑒定；

2）規(guī)范細胞傳代的各個步驟，避免細胞的交叉污染；

3）嚴格控制傳代次數(shù)，20 代以內(nèi)的細胞制樣最佳。

2. 胰蛋白酶剪切

解析：

樣品制備時，我們一般會使用胰蛋白酶消化一下細胞，此時有一些目的蛋白會被剪切成短片段，而這些短片段通常會被識別，從而出現(xiàn)「雜帶」。

對策：

針對該類樣本，不要使用蛋白酶消化，可以改用刮刀收集或直接加裂解液到細胞皿或細胞瓶中直接裂解。

3. 血液及血液制品干擾

解析：

血液里的 IgG 被二抗識別而出現(xiàn)雜帶。IgG 的重鏈和輕鏈在電泳過程中分離，且剛好該 IgG 與一抗同源，均被二抗識別而出現(xiàn)雜帶；一般重鏈條帶在 55 kDa 左右，輕鏈在 25 kDa 左右。

對策：

細胞和組織樣品，尤其是對于血含量多的組織（如：心、肝、脾、腎等），在裂解前需要充分的清洗，以完全去除血液和血清殘留。

4. 還原不徹底

解析：

蛋白樣品由于加的還原劑量不足或沒加而導(dǎo)致蛋白還原不徹底，以二聚體或多聚體存在，形成分子量更大的雜帶。

對策：

1）樣品制備時添加足量的還原劑，推薦 1X Loading Buffer 至少加 5% BME 或 100 mM DTT；

2）-20℃ 或 -80℃ 分裝保存的樣品在存放半年后，補加還原劑并 100℃ 煮樣 5 分鐘后再使用。

5. 內(nèi)源蛋白酶剪切

解析：

樣品在制樣過程中，除去人為添加的胰蛋白酶，內(nèi)源的蛋白酶也會被釋放到裂解液中，靶標蛋白會在一定的程度上被降解、碎片化，形成片段更小的雜帶。

對策：

1）提取過程全程保持低溫，降低蛋白酶活性；

2）裂解液中加入高質(zhì)量的蛋白酶抑制劑，如 Proteintech 蛋白酶抑制劑混合液；

3）對于組織樣品，盡量取新鮮的樣品制備，制備方法選用液氮研磨的方法，將樣品降解可能降到最低；

4）樣品制備好后及時使用，如需保存可分裝成數(shù)管保存在 -20℃ 或 -80℃ 冰箱，避免反復(fù)凍融。

6. 裂解不充分 

解析：

由于樣本制備過程中裂解液加入量過少，導(dǎo)致樣品裂解不充分，凝膠孔中有大顆粒殘留。

對策：

樣品裂解時需要加充足的裂解液，推薦裂解液與細胞體積比至少為 3:1，不同組織和細胞之間需要調(diào)整。裂解完成后樣品濃度保持在 3-6 ug/ul 比較理想。

7. 樣品粘度大

解析：

樣品沒有超聲或超聲不徹底導(dǎo)致核酸未被打斷成小片段，從而導(dǎo)致樣品粘度高，WB 結(jié)果出現(xiàn)拖尾等雜帶。

對策：

1）樣品制備過程中對樣品進行超聲波處理（推薦 1 ml 的樣品使用 200 W 超聲 2 分鐘），徹底的將核酸打斷。

2）存放一段時間的樣品如果出現(xiàn)粘稠，在使用前用超聲波處理直至不再粘稠。

8. 上樣量過多

解析：

在 WB 實驗中，樣品上樣量過多，由于部分蛋白與抗體的非特異性結(jié)合增加，也會導(dǎo)致雜帶的出現(xiàn)。

對策：

實驗時可以做一個樣本濃度梯度上樣，根據(jù)靶標抗體的表達情況選擇合適的上樣量。
 

「道理都懂，狀況頻出」。理想和現(xiàn)實之間總是有些差距，稍微有一點細節(jié)沒注意就有可能中招。所以小伙伴們在制樣時一定要多注意細節(jié)，避免上述問題。
 

以下是 Proteintech 公司資深樣品制備實驗員為大家總結(jié)的樣品制備關(guān)鍵細節(jié)清單，希望對你們有幫助：

1）樣本制備的所有步驟必須低溫下進行（冷血動物樣品除外），所有試劑都需提前預(yù)冷。

2）細胞來源可靠（有 STR 鑒定），傳代次數(shù)不要過多，20 代以內(nèi)的細胞制樣最佳。

3）收集細胞不建議使用胰蛋白酶消化，可以選擇在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿內(nèi)直接裂解或用細胞刮收集細胞后再裂解。

4）對于組織樣品，盡量取新鮮的樣品制備。尤其是消化系統(tǒng)相關(guān)的組織，制備推薦選用液氮研磨的方法，在不影響提取效果的前提下，可以考慮高濃度 SDS 等強烈的裂解液以縮短裂解時間。

5）使用預(yù)冷的 PBS 洗凈細胞及組織中的外源蛋白和脂類，尤其是細胞培養(yǎng)液中的牛血清和組織塊中的血液。對于血含量多的組織（如：心、肝、脾、腎等）可以使用 200 目的網(wǎng)篩將其磨成單個細胞后再清洗，清洗的 PBS 中需加入適量的蛋白酶抑制劑。

6）樣品制備過程中需加入蛋白酶抑制劑，針對蛋白含量高或容易降解的細胞或組織可以加倍使用。用于磷酸化靶標抗體的檢測還需加入磷酸酶抑制劑。

7）加入足量的裂解液不僅可以得到更多的可溶性蛋白，而且可以降低蛋白質(zhì)的聚集和黏度。推薦裂解液與細胞體積比至少為 3:1，不同組織和細胞之間需要調(diào)整。裂解完成后樣品濃度保持在 3-6 ug/ul 比較理想。

8）超聲破碎這一步十分重要，尤其對于核蛋白的提取極有幫助。通過超聲波可以將核酸打斷成小片段，從而使其不能形成完整的蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域而最終與蛋白分開。

9）還原劑需現(xiàn)用現(xiàn)加，量要加足, 推薦每 1X 的蛋白上樣緩沖液（1X loading buffer）中至少加 5% BME 或 100 mM DTT。存放半年以上的樣品需補加還原劑煮樣后再使用。

10）蛋白樣品提取完成后，建議用 BCA 法準確測定濃度，并將樣品的蛋白濃度和鹽離子濃度調(diào)到一致，以確保上樣量清楚可控。

11）樣品最好現(xiàn)制現(xiàn)用，如需保存，可分裝成數(shù)管保存在 -20℃ 或 -80℃ 冰箱，避免反復(fù)凍融。保存半年以上的樣品，推薦在使用前補加還原劑沸水煮樣后再使用。

最后，針對蛋白樣本制備中可能會用到的蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，Proteintech 也可提供經(jīng)過咱們反復(fù)錘煉的優(yōu)秀產(chǎn)品，這里給大家做個推薦，有需要的可以嘗試哦 ～

1. 蛋白酶抑制劑混合液（貨號：PR20016）

2. 磷酸酶抑制劑混合液（貨號：PR20015）
 

好啦，以上就是今天要和大家分享的全部內(nèi)容，希望對你們有幫助 ～