過去幾年中，成功使用免疫療法幫助抗擊癌癥的范圍迅速擴大，許多療法現已獲批用于臨床。其中嵌合抗原受體（CAR）T細胞的引入在該領域處于領先地位。CAR構建體旨在與腫瘤細胞上存在的特異性表面表位或抗原相互作用，一旦接近就能使T細胞殺死腫瘤細胞，同時不傷害健康細胞。當腫瘤細胞上的特定抗原可被識別時，CAR-T細胞就會顯示出靶向作用，并且由于其來自于患者自身（稱為自體療法），因此沒有排斥反應。

CD19靶向CAR-T細胞療法，例如Kymriah®（Novarits）或Yescarta®（Kite/Gilead），已經在淋巴細胞白血病和非霍奇金淋巴瘤等常見的液體腫瘤治療中取得臨床成功。如圖1所示，自體CAR-T材料的開發(fā)和擴增涉及多個階段。在所有階段，均需要對所產生的產品進行質量和功能評估，同時最大程度地縮短從最初捐贈到重新引入患者體內的時間。
 
iQue® 高通量流式細胞儀作為一種高通量、多參數、低成本的細胞定量分析工具，為進一步提升CAR-T細胞的構建效率以及治療反應等提供解決方案。
 
接下來，我們通過兩個案例分享一下iQue® 3高通量流式細胞儀是如何助力CAR-T細胞表征的吧！

應用                                                      CD19-靶向CAR-T細胞的
案例1                                                           特異性殺傷特征

CAR-T細胞具備特異性殺傷功能。為了在體外證明這種特異性，首先將抗CD19 CAR轉導的T細胞或供體匹配的模擬轉導T細胞用于Incucyte® 免疫細胞殺傷試驗。在收集圖像的同時，分別于第2天、第4天和第7天取樣，在iQue® 高通量流式細胞儀上利用iQue® 人類T細胞活化試劑盒和iQue®人類T細胞殺傷試劑盒評估了表型和功能，并通過iQue® 人類T細胞配套試劑盒量化細胞因子IL-2。這些試劑盒能對T細胞表面標志物和指示T細胞活化和腫瘤細胞殺傷的分泌蛋白進行量化。結果顯示，當與抗原陽性的Ramos細胞結合時，CD8+細胞上的T細胞活化標志物CD69、CD25和PD-1（分別為圖2A-C）迅速上調。該上調表現出一定的時間依賴性，在第7天觀察到的水平最高，但CAR-T細胞密度之間幾乎沒有差異。在與抗原陰性的Jurkat細胞共培養(yǎng)或在有模擬轉導的T細胞存在的情況下，所有3種活化標志物的表達均很低（<7%）。存在Ramos細胞的情況下，分泌的細胞因子IFNγ和IL-2（活化指標）的濃度在早期時間點增加，但到第7天有所下降，表明是瞬態(tài)響應。在含有CAR-T細胞的共培養(yǎng)物中，細胞殺傷力的指標——顆粒酶B的釋放增加，但僅在抗原陽性的Ramos細胞存在時發(fā)生。對于所有分泌蛋白，隨著CAR-T密度的增加，水平普遍有所增加。總的來說，這種完整的量化分析結果顯示了抗CD19 CAR-T細胞明確的抗原特異性活化，這是由表面標志物和分泌蛋白與殺死表達抗原的腫瘤細胞的功能指標共同判定的。
 
應用                                                                抗原激發(fā)下
案例2                                                     CAR-T細胞的耗竭表征

重復暴露于腫瘤細胞抗原可導致CAR-T細胞耗竭。研究耗竭的CAR-T細胞的表型有助于提高我們對這種耗竭如何影響臨床響應的持續(xù)時間的理解。為了在體外研究這個問題，通過不斷用抗原陽性的Ramos細胞系激發(fā)抗CD19的CAR-T細胞誘導CAR-T細胞耗竭。每隔2-3天，持續(xù)10天，對CAR-T細胞進行計數，并用新鮮的Ramos細胞（1:1 T:E）重新刺激。第11天，對刺激的CAR-T細胞進行計數，并與Ramos細胞（1:1 T:E）接種到96孔板上。在與Ramos共培養(yǎng)和作為單一培養(yǎng)的情況下，接種一個新鮮批次的未耗竭CAR-T細胞進行比較。每天從檢測板的所有孔中提取細胞因子樣品（10 μL），72小時后，使用iQue®人類T細胞耗竭試劑盒對細胞和上清液進行量化。結果如圖3所示。
 
細胞因子的分泌，包括IFNγ和TNFα，在含有耗竭的CAR-T和Ramos細胞共培養(yǎng)的孔中均很低（圖3A和B）。相對而言，新鮮CAR-T細胞分泌的IFNγ和TNFα水平明顯較高，48小時的峰值濃度分別為3.5±0.2 ng/mL和0.6±0.1 ng/mL。新鮮的CAR-T細胞在單一培養(yǎng)中產生的每種細胞因子的水平都很低。在有重復抗原激發(fā)的T細胞的孔中，這種細胞因子分泌的明顯損失是其枯竭的一個明顯標志。72小時后，LAG-3衰竭標志物的表達在激發(fā)的CAR-T細胞中高度升高，86±0.3%的CD4+細胞群對這種表型呈陽性，而新鮮刺激的CD4+CAR-T細胞僅有31±0.6%的表達（圖3C）。CAR-T細胞單一培養(yǎng)有一小部分細胞群對LAG-3呈陽性（17±0.8%）。在共培養(yǎng)孵育中，也觀察到耗竭CAR-T細胞殺傷靶細胞的能力有所下降（圖3D）。非耗竭的CAR-T細胞能夠比耗竭的CAR-T細胞更有效地減少Ramos細胞數量，從含有非耗竭的CAR-T細胞的孔中，iQue® 獲得的數值平均為每sip 4606±463個細胞，而耗竭的CAR-T細胞為每sip 8483±688個細胞。T細胞殺傷靶細胞的能力下降是耗竭的另一個標志。綜上，這種完整的量化結果顯示了這些抗-CD19的CAR-T細胞有明顯的抗原特異性驅動的耗竭特征。

Summary

眼明心亮的同學不難從兩個案例看出，iQue® 高通量流式細胞儀不僅可以在極低的樣品消耗量下準確定量檢測相應的生物學指標，同時提供完善的配套試劑。例如，上述兩個案例中提到的iQue®人類T細胞活化試劑盒、iQue®人類T細胞殺傷試劑盒、iQue®人類T細胞配套試劑盒量化細胞因子IL-2以及iQue®人類T細胞耗竭試劑盒（圖4）。為大家提供了更優(yōu)的工作效率和樣品前處理體驗。
 
細胞療法的使用正在迅速發(fā)展，人們越來越關注提高用于臨床的細胞生產效率。使用先進生物分析技術能夠助力改善構建體的壽命、選擇性，優(yōu)化生產工藝以及安全性。iQue® 3高通量流式細胞儀為新一代CAR-T開發(fā)提供智能的解決方案。

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下載白皮書《使用先進的流式細胞術和活細胞分析進行CAR-T 細胞表型和功能表征》