隨著重組DNA技術(shù)的迅猛發(fā)展，外源基因在不同宿主中的表達(dá)使得各種重組蛋白的工業(yè)生物生產(chǎn)成為可能。選擇合適的宿主是生物工藝設(shè)計(jì)中的關(guān)鍵步驟之一，具體取決于：

1.上游培養(yǎng)效率

2.易于基因編輯和分子工具的可用性

3.翻譯后修飾的能力，如糖基化

4.蛋白質(zhì)（用于下游加工和作為生物制藥成分等）的分泌能力

目前，多種生物已被應(yīng)用于重組蛋白的生產(chǎn)，尤其是大腸桿菌，易于基因改造，具有在酵母水解物等多種基質(zhì)上快速生長并產(chǎn)生高蛋白滴度的優(yōu)勢(shì)。已成為迄今為止業(yè)界追捧的主力軍。

典型的生物工藝優(yōu)化通常需要進(jìn)行一些初步試驗(yàn)，以發(fā)現(xiàn)適用于宿主菌株并提高目的重組蛋白表達(dá)的培養(yǎng)基成分（特別是氮基營養(yǎng)素）。對(duì)于此類應(yīng)用需求，能夠提高實(shí)驗(yàn)效率和參數(shù)準(zhǔn)確度的高通量篩選平臺(tái)成為熱門工具。貝克曼庫爾特BioLector通過在線測(cè)量關(guān)鍵培養(yǎng)參數(shù)提供可放大的高通量分析。

本案例為通過BioLector對(duì)多種酵母營養(yǎng)素就生物量生長和重組蛋白的形成進(jìn)行評(píng)估和比較，篩選出了適合大腸桿菌重組蛋白生產(chǎn)和誘導(dǎo)時(shí)間的理想培養(yǎng)基。

方法

培養(yǎng)菌株：大腸桿菌BL21(DE3)pET-28a(+)EcFbFP。

培養(yǎng)基：以標(biāo)準(zhǔn)TB培養(yǎng)基（Carl Roth）為參照物，對(duì)多個(gè)TB 樣（Terrific 液）培養(yǎng)基進(jìn)行比較。不同的TB 樣培養(yǎng)基使用不同的酵母提取物。

BioLector培養(yǎng)條件：在接種至微孔板之前，先在250 mL搖瓶中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)， 37°C培養(yǎng)6小時(shí)。然后使用48孔梅花板（MTP-BOH2）在 BioLector中進(jìn)行培養(yǎng)。溫度 37°C ，振搖速度：1400 rpm。分別在每個(gè)培養(yǎng)孔中填充800μL培養(yǎng)液用于非誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，填充790μL用于誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，在誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)上添加 10μL 50μM 的 IPTG。環(huán)境氧氣濃度保持在35%，避免培養(yǎng)物缺氧。

BioLector在線測(cè)量：培養(yǎng)過程中對(duì)生物量、EcFbFP(黃素?zé)晒獾鞍?、pH以及 DO進(jìn)行在線測(cè)量。

結(jié)果

不同TB樣培養(yǎng)基的生物量生長情況：

培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，不同酵母營養(yǎng)素的培養(yǎng)基中生物量的生長情況如上圖所示：培養(yǎng)基不同，最終的光密度和生長速率也會(huì)不同。ProCel 6 中的大腸桿菌OD最高，培養(yǎng)基 ProCel 3 中的大腸桿菌的OD低。ProCel 6為本特定工藝的最高生長速率。

上圖為培養(yǎng)過程的DO值。培養(yǎng)基 ProCel 3 和 ProCel 4 中的培養(yǎng)物未達(dá)到0%的氧飽和度，這表明由于耗氧量有限，該培養(yǎng)基中的菌株代謝活性較低。相反，其他培養(yǎng)物包括TB標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，均在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到0%的氧飽和度，表明菌株代謝活性高。

不同酵母營養(yǎng)素TB樣培養(yǎng)基的產(chǎn)物生成：

通過將IPTG 添加到培養(yǎng)物中來誘導(dǎo) T7 聚合酶的表達(dá)促進(jìn)黃素?zé)晒獾鞍椎纳�成。BioLector使用梅花板為48個(gè)培養(yǎng)物提供了獨(dú)立的培養(yǎng)空間，因此可測(cè)試不同的誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)。使用自動(dòng)化工作站整合BioLector后的 RoboLector 系統(tǒng)還可以自動(dòng)進(jìn)行培養(yǎng)誘導(dǎo)。

首先選擇一個(gè)固定的誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)。分別為培養(yǎng)啟動(dòng)后的3小時(shí)、3.75小時(shí)和4.5小時(shí)。下圖所示為每種TB樣培養(yǎng)基在誘導(dǎo)時(shí)間下所測(cè)熒光的平均值。熒光動(dòng)力學(xué)清晰地表明不同培養(yǎng)基有不同的EcFbFP（黃素?zé)晒獾鞍祝┍磉_(dá)水平。

表現(xiàn)出最強(qiáng)熒光信號(hào)的兩個(gè)樣本為：ProCel 2，誘導(dǎo)點(diǎn)為3.75小時(shí)；ProCel 5，誘導(dǎo)點(diǎn)為 3 小時(shí)。經(jīng)過 7.7 小時(shí)的培養(yǎng)，ProCel 5 的熒光值達(dá)到102.94a.u.，而ProCel 2 的熒光值達(dá)到 101.82 a.u.。本方法的不足之處在于未比較不同樣本的生物量對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)量的影響。經(jīng)過3小時(shí)的培養(yǎng)，一些培養(yǎng)物的OD已達(dá)到6，而其他培養(yǎng)物僅達(dá)到3。當(dāng)誘導(dǎo)具有不同光密度的培養(yǎng)物時(shí)，可能會(huì)對(duì)在每種酵母營養(yǎng)素上生長的實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的蛋白質(zhì)生產(chǎn)性能造成誤解。

鑒于此，我們采用了一種新方法，將誘導(dǎo)點(diǎn)與生物量信號(hào)耦合。使用BioLector的信號(hào)驅(qū)動(dòng)RoboLector，依賴于特定生物量的誘導(dǎo)對(duì)于每個(gè)單獨(dú)的孔都是可行的。為自動(dòng)化工作站設(shè)置3、6或8的OD目標(biāo)值，以根據(jù)孔內(nèi)培養(yǎng)物的生長動(dòng)力學(xué)自動(dòng)添加IPTG以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)生產(chǎn)。

如下圖所示，ProCel 2表現(xiàn)最佳，最終值為 146.23 a.u.，培養(yǎng)時(shí)間是 12.3 小時(shí)；ProCel 5表現(xiàn)次之，最終值為138.1 a.u.。與之前進(jìn)行的一系列實(shí)驗(yàn)相比，本實(shí)驗(yàn)中的排名與在特定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)不同。這一觀察證明了最佳工藝條件的重要性，并使這些條件具有可比性。此處數(shù)據(jù)表明：與之前的實(shí)驗(yàn)相比，本實(shí)驗(yàn)中的熒光值更高。正如該領(lǐng)域諸多論文中所強(qiáng)調(diào)的那樣，誘導(dǎo)時(shí)間確實(shí)是一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。同樣，在優(yōu)化大腸桿菌重組蛋白生產(chǎn)的過程中，也必須評(píng)估誘導(dǎo)劑的濃度。另外，與對(duì)照TB培養(yǎng)基相比，這里測(cè)試的一些酵母氮源產(chǎn)生了更高的重組蛋白產(chǎn)量。這些結(jié)果凸顯了選擇培養(yǎng)基成分的重要性，這些成分能夠在特定的生物工藝中實(shí)現(xiàn)高而穩(wěn)定的產(chǎn)量。

結(jié)論

通過BioLector系統(tǒng)，貝克曼庫爾特可為用戶提供適用于各種應(yīng)用領(lǐng)域的高通量篩選平臺(tái)。其獨(dú)特的梅花形微孔板尤其適用于好氧培養(yǎng)，如同實(shí)驗(yàn)室生物反應(yīng)器，BioLector系統(tǒng)通過非侵入式傳感器使客戶能夠獲取更多的在線測(cè)量參數(shù)。正如本應(yīng)用，通過BioLector系統(tǒng)可輕松實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基的篩選，整合自動(dòng)化工作站的RoboLector，還可實(shí)現(xiàn)更多功能。補(bǔ)料、pH調(diào)控以及文中所述的誘導(dǎo)功能，所有這些均可在小規(guī)模實(shí)驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)，幫助客戶同時(shí)兼顧成本和效率。

RoboLector高通量自動(dòng)化微型生物培養(yǎng)平臺(tái)

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