新發(fā)傳染病（emerging infectious diseases，EID）至少占所有人類病原體的 15%，比如流感病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒、冠狀病毒（SARS/SARS-CoV-2）等，對(duì)公共衛(wèi)生構(gòu)成重大負(fù)擔(dān)^[1]。新冠病毒具備極強(qiáng)的感染能力，傳播能力和突變能力，對(duì)其如何進(jìn)行有效地預(yù)防和控制以及治療成為全球面臨的問(wèn)題。
疫苗接種是應(yīng)對(duì)傳染病最成功的預(yù)防和控制的方式，然而疫苗的開(kāi)發(fā)過(guò)程往往是漫長(zhǎng)的，也是昂貴的^[2][3]。這就要求科學(xué)家們需要以極快的速度通過(guò)更新穎的方法來(lái)開(kāi)發(fā)新的疫苗，來(lái)應(yīng)對(duì)傳染病的爆發(fā)。

目前，針對(duì)新冠病毒已經(jīng)開(kāi)發(fā)了如滅活疫苗、重組蛋白疫苗、腺病毒疫苗、mRNA疫苗等多種安全有效的疫苗。但仍然有許多挑戰(zhàn)需要克服，如下圖所示：
以上這些挑戰(zhàn)和面臨的問(wèn)題在疫苗的研發(fā)生產(chǎn)的不同環(huán)節(jié)均有所體現(xiàn)：

●病原體的發(fā)現(xiàn)和表征
●患者的免疫反應(yīng)特征
●疫苗的功能和有效性評(píng)估
●生產(chǎn)過(guò)程定量及質(zhì)控分析
賽多利斯生物分析產(chǎn)品 Octet®、Incucyte®和iQue®蛋白質(zhì)和細(xì)胞分析平臺(tái)為更快的疫苗發(fā)現(xiàn)、表征和開(kāi)發(fā)提供創(chuàng)新的高通量和自動(dòng)化解決方案，可輕松應(yīng)對(duì)以上諸多挑戰(zhàn)，極大地簡(jiǎn)化了工作流程，加快了研發(fā)進(jìn)度。
下面陳老濕就通過(guò)幾個(gè)國(guó)內(nèi)外研究案例詳細(xì)介紹高通量生物分析技術(shù)在疫苗設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)過(guò)程中的應(yīng)用。
  病原體的發(fā)現(xiàn)和表征

2020年1月10日，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心發(fā)布了SARS-CoV-2基因組的初始序列^[4]，并在2020 年 1 月 29日和2 月 3 日在線發(fā)布了完整的病毒基因組序列^[5]�；�于其與SARS病毒的相似性，新冠病毒的棘突蛋白（S蛋白）成為研究的熱點(diǎn)和突破口之一。復(fù)旦大學(xué)的應(yīng)天雷等人最早通過(guò)親和力實(shí)驗(yàn)證明了SARS-CoV-2  S蛋白的RBD結(jié)構(gòu)域可與人的ACE2受體結(jié)合^[6]，親和力與報(bào)道的SARS的S-RBD和ACE2的親和力接近^[7]。 華盛頓大學(xué)的David Veesler等人通過(guò)結(jié)構(gòu)學(xué)分析來(lái)研究 S 蛋白的特性。SARS-CoV-2 S蛋白三聚體具有兩種結(jié)構(gòu)：50%三聚體的三個(gè)S蛋白都處于閉合位置，而50%的三聚體的一個(gè) S 蛋白處于開(kāi)放位置，另外兩個(gè)S 蛋白處于閉合位置。這些結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)可以幫助科學(xué)家設(shè)計(jì)阻止病毒S蛋白與宿主細(xì)胞ACE2 受體結(jié)合的抑制劑。此外，Octet®檢測(cè)顯示，SARS-CoV-2和SARS-CoV的S蛋白與 ACE2 具有相似的親和力和結(jié)合速率，但是SARS-CoV-2的解離速率更慢^[8]。 隨后越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室和數(shù)據(jù)證明，SARS-CoV-2 S蛋白直接識(shí)別并與易感細(xì)胞的ACE2 結(jié)合，是病毒感染的關(guān)鍵步驟。闡明 SARS-CoV-2 S蛋白及其受體結(jié)合域 ( RBD ) 上的免疫原性特征，就會(huì)為有效的疫苗和抗體療法的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

患者的免疫反應(yīng)特征

紐約大學(xué)的Hattori等人開(kāi)發(fā)了一種不結(jié)合 ACE2 的S-RBD突變體（RBD-T），用于表征94位COVID-19患者血清中的抗 RBD 抗體^[9]。他們使用iQue®高通量流式細(xì)胞儀進(jìn)行了基于細(xì)胞和微球的結(jié)合分析。噬菌體展示庫(kù)中結(jié)合S蛋白的大多數(shù)克隆 ( 89% )不能結(jié)合RBD（如A4-2）。部分針對(duì)RBD的抗體可以識(shí)別RBD和RBD-T，對(duì)S蛋白的識(shí)別較弱 (如B3-4 )。只有 12%的結(jié)合S蛋白和 RBD的抗體可以識(shí)別 ACE2 相互作用位點(diǎn)( 如C3-3)。
這說(shuō)明與 ACE2 相互作用的 RBD 表面的免疫原性低于 S 蛋白和RBD的其他區(qū)域，預(yù)示著選擇完整的S蛋白三聚體作為疫苗的免疫原也許更合適。那么進(jìn)一步分析S 蛋白三聚體的開(kāi)放或封閉位置的免疫原特性就是必要的。特拉維夫大學(xué)的Mor 等人分析了重度和輕度COVID-19患者血液中抗體反應(yīng)的細(xì)胞、分子和功能特征^[10] 。他們使用 Incucyte® S3活細(xì)胞分析系統(tǒng)監(jiān)測(cè) SARS-CoV-2 感染誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和細(xì)胞間融合，以及分離的SARS-CoV-2中和抗體的效果。結(jié)果表明，與恢復(fù)期患者相比，重癥新冠肺炎患者表現(xiàn)出高滴度的抗RBD的中和抗體水平以及更高的B細(xì)胞擴(kuò)增能力。 如上圖所示，在活細(xì)胞試驗(yàn)中，紅色熒光信號(hào)越弱，代表抗體對(duì)病毒的中和抑制作用越強(qiáng)。與對(duì)照抗體G053 相比，分離的22個(gè)抗體中有6個(gè)能有效中和活病毒并防止合胞體的形成。病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，加入1，10和100ug/mL的抗體后連續(xù)監(jiān)測(cè)60h，TAU-2212 和 TAU-2230等抗體可以顯著地降低細(xì)胞的死亡，展示了它們的病毒中和能力。

疫苗的功能和有效性評(píng)估

mRNA疫苗作為新型疫苗類型，以其設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便，構(gòu)建快速，通用性強(qiáng)、易擴(kuò)大生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)備受關(guān)注。它很適合用于應(yīng)對(duì)大范圍的新發(fā)傳染病的控制。但是，從體外核酸到體內(nèi)表達(dá)出抗原蛋白，如何有效地評(píng)價(jià)其功能？ 輝瑞&BioNtech的mRNA疫苗（BNT162b2）在其遞交給歐洲藥物管理局（EMA）的評(píng)估報(bào)告^[11]中提到，利用Octet®分子互作儀（生物層干涉技術(shù)原理）來(lái)測(cè)定mRNA表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)合活性。通過(guò)生物傳感器分別固化ACE2和抗體，與293T細(xì)胞中表達(dá)的不同濃度的S蛋白（疫苗表達(dá)產(chǎn)物）進(jìn)行親和力測(cè)定。兩者的親和力均在nM級(jí)別，符合正常S蛋白與受體及中和抗體的結(jié)合能力，并以此作為疫苗功能確認(rèn)的指標(biāo)之一。

除了mRNA疫苗，滅活疫苗是更安全的傳統(tǒng)疫苗，那么目前滅活疫苗打2針，打3針有什么區(qū)別呢？

中科院生物物理所等單位聯(lián)合發(fā)文^[12]，發(fā)現(xiàn)接種第3針滅活疫苗有更好的新冠病毒突變體的廣譜中和活性，可快速引發(fā)B細(xì)胞記憶能力和更持久的體液應(yīng)答，增強(qiáng)免疫反應(yīng)。他們將構(gòu)建的171株抗體在RBD上的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行表位分析，分為I-VI組。通過(guò)Octet®親和力檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，識(shí)別IV,V,VI部位的抗體對(duì)突變敏感度較低。
并且，打過(guò)第3針后的抗體親和力水平總體高于2劑疫苗（3劑苗KD < 1 nM，2劑苗2.31 nM≤ KD≤ 7.75 nM）。3劑苗對(duì)突變體的中和能力之所以更強(qiáng)，可能是因?yàn)榈?針引發(fā)針對(duì)IV-VI部位的抗體比率的增加。
重組蛋白疫苗和病毒載體疫苗的本質(zhì)就是抗原蛋白和病毒顆粒。在生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)其不同階段進(jìn)行濃度分析和監(jiān)測(cè)就是必需的工作之一。目前Octet®以其獨(dú)特的定量?jī)?yōu)勢(shì)，在流感，HPV疫苗等工藝過(guò)程控制以及成品的快速質(zhì)控中開(kāi)始成為高效的工具之一。 將疫苗的抗體固化在傳感器上檢測(cè)疫苗濃度，整個(gè)實(shí)驗(yàn)在10分鐘內(nèi)完成。線性范圍在0.1~1000ug/mL，覆蓋疫苗生產(chǎn)過(guò)程中的濃度范圍，且樣品不需要稀釋^[13]。
Novavax公司的新冠重組蛋白疫苗Nuvaxovid已在歐盟開(kāi)始使用，也是歐盟批準(zhǔn)的第五個(gè)新冠疫苗。Novavax公司的新冠重組蛋白疫苗Nuvaxovid已在歐盟開(kāi)始使用，也是歐盟批準(zhǔn)的第五個(gè)新冠疫苗。Nuvaxovid（NVX CoV2373）是一種納米顆粒疫苗，由融合前的SARS-CoV-2 S蛋白三聚體和Matrix-M1佐劑組成。根據(jù)III期臨床結(jié)果，在人體內(nèi)可產(chǎn)生極高的抗體滴度。該疫苗的親和力質(zhì)控由Octet®完成，作為質(zhì)量表征屬性的生物學(xué)活性指標(biāo)^[14]。 S1/S2亞基剪切位點(diǎn)682-RRAR-685突變到682-QQAQ-685，以及位于CH的986/987位氨基酸殘基突變成了脯氨酸。突變后解離更慢，親和力明顯增強(qiáng)。
新冠病毒仍然在不斷突變和演化過(guò)程中，應(yīng)對(duì)奧密克戎株的新冠疫苗也已經(jīng)開(kāi)始進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。無(wú)論是現(xiàn)在還是將來(lái)，針對(duì)新發(fā)傳染病的病原體研究和相關(guān)疫苗及藥物的開(kāi)發(fā)，仍然是持續(xù)不變的課題。如何在不同步驟和階段進(jìn)行快速高效的研究，縮短整個(gè)開(kāi)發(fā)周期，這就顯得非常重要。賽多利斯生物分析部門提供的高通量分析設(shè)備可以分別在蛋白和細(xì)胞水平對(duì)多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的小樣本量的眾多變量進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，既保證速度和效率，又可以節(jié)約時(shí)間和成本。除了以上案例，對(duì)于新型、有效的療法和疫苗的開(kāi)發(fā)，還具備更廣泛的應(yīng)用（如下表所示）。 Download

賽多利斯與Wiley雜志聯(lián)合編輯出版《疫苗發(fā)現(xiàn)與開(kāi)發(fā)：COVID-19的啟示》，匯總了各類疫苗開(kāi)發(fā)及生產(chǎn)的流程及面臨的關(guān)鍵挑戰(zhàn)，以及賽多利斯解決方案如何為疫苗發(fā)現(xiàn)、表征和開(kāi)發(fā)提供創(chuàng)新的高通量和自動(dòng)化解決方案。   -參考文獻(xiàn)- 

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