華盛頓大學(xué)研究人員YuanDong Li等在1.3μm譜域光學(xué)相干斷層掃描（SD-OCT）系統(tǒng)中，結(jié)合使用液體變焦鏡頭（也稱electrically tunable lens, ETL），突破了傳統(tǒng)OCT系統(tǒng)在小鼠大腦皮質(zhì)OCT血管造影（OCTA）中的焦深限制。液體變焦鏡頭能夠快速并動(dòng)態(tài)地控制探針光束沿小鼠整個(gè)皮質(zhì)的軸向聚焦，在此基礎(chǔ)上，通過將六個(gè)焦深的OCTA圖像拼接到一起，實(shí)現(xiàn)了對(duì)皮質(zhì)各層的腦血流成像。成像結(jié)果揭示了各皮質(zhì)層的毛細(xì)血管系統(tǒng)和軸向血流速度，并首次揭示了腦白質(zhì)中的毛細(xì)血管系統(tǒng)和軸向血流速度。因此該集成系統(tǒng)有助于研究小鼠大腦深層皮質(zhì)中的血流動(dòng)力學(xué)。同時(shí)液體變焦鏡頭的緊湊集成，對(duì)未來手持式或腔內(nèi)OCT探頭的設(shè)計(jì)也有很大啟發(fā)作用。研究成果以“Electrically tunable lens integrated with optical coherence tomographyangiography for cerebral blood flow imaging in deep cortical layers in mice”為題發(fā)表于《Optics Letters》。


  背景

 大腦皮質(zhì)沿軸線可分為六個(gè)生理層，以細(xì)胞類型和密度區(qū)分。如小鼠大腦中，主要的傳出錐體神經(jīng)元大部分位于皮質(zhì)的第三和第五層。神經(jīng)生理差異是的這些皮質(zhì)層在功能活動(dòng)期間的代謝需求不同，而功能行活動(dòng)受血流的空間和時(shí)間調(diào)節(jié)支持。使用功能磁共振成像的研究顯示了貓?jiān)谝曈X刺激期間，大腦皮質(zhì)中部的最大血流量變化，但成像分辨率不足以確定峰值血流量變化的確切位置。其他研究使用團(tuán)注追蹤觀察大鼠體感皮質(zhì)激活期間，第四層中最早和最大量的紅細(xì)胞到達(dá)，但僅捕獲了幾個(gè)小動(dòng)脈來估計(jì)時(shí)間信號(hào)的變化。到目前為止，還沒有實(shí)現(xiàn)對(duì)特定皮質(zhì)層，特別是深層皮質(zhì)的毛細(xì)血管系統(tǒng)和血流動(dòng)力學(xué)的直接成像，這阻礙了對(duì)神經(jīng)血管耦合和皮質(zhì)功能的系統(tǒng)研究。

 光學(xué)相干斷層掃描血管造影術(shù)（OCTA）是一種新興的神經(jīng)血管研究工具，可對(duì)嚙齒動(dòng)物血流進(jìn)行高分辨率的三維血流成像以及速度繪圖，并且視野大（幾厘米）、不需要造影劑。OCTA的擴(kuò)展，毛細(xì)血管測(cè)速法，揭示了在感覺刺激期間，激活的小鼠皮質(zhì)中的毛細(xì)血管流均勻化及其對(duì)腦氧合的貢獻(xiàn)。在衰老和阿爾茨海默病研究中，毛細(xì)血管測(cè)速法還幫助探究了與病理相關(guān)的毛細(xì)血管通過時(shí)間不均勻性變化。

 然而這些研究只能量化皮質(zhì)表面下300μm淺深度內(nèi)的動(dòng)態(tài)信號(hào)，僅到達(dá)小鼠皮質(zhì)的第三層。原因在于使用高斯光學(xué)（Gaussian optics）將OCT光束傳送到皮質(zhì)組織中，其中聚焦深度（DOF）（∼λ∕NA2）與橫向分辨率（∼λ∕2NA）是互相關(guān)聯(lián)的。使用高數(shù)值孔徑和銳聚焦時(shí)，只選擇了達(dá)到系統(tǒng)所需橫向分辨率的一小部分深度范圍（以O(shè)CT光束的瑞利長度區(qū)分）用于毛細(xì)血管血流定量。

 在不犧牲橫向分辨率的情況下，擴(kuò)展DOF的一個(gè)有用且實(shí)用的解決方案是沿著成像對(duì)象的深度移動(dòng)探測(cè)光束的軸向焦點(diǎn)。但在腦血流成像中，該方法很難精確定位皮質(zhì)層平面，無法快速有效地捕獲神經(jīng)-血管耦合期間多個(gè)大腦層中的血液動(dòng)力學(xué)響應(yīng)。因此軸向移動(dòng)掃描光學(xué)器件或平移成像平臺(tái)不可行。

 本研究創(chuàng)新性地將液體變焦鏡頭與SD-OCT系統(tǒng)結(jié)合，對(duì)小鼠皮質(zhì)腦血流進(jìn)行了多焦平面成像（圖1）。集成系統(tǒng)包括一個(gè)寬帶超發(fā)光二極管（SLD）光源，中心波長1340nm，帶寬110nm（-3dB）。該光源的軸向分辨率在空氣中約7.5μm（小鼠腦組織中約5.1μm）。干涉儀的輸出光導(dǎo)入一個(gè)自制光譜儀中，其光譜分辨率約0.141nm，可檢測(cè)深度范圍約3mm。光譜儀使用的線陣相機(jī)（1024像素檢測(cè)器陣列，Goodrich Inc.）線掃描速率為92kHz。系統(tǒng)靈敏度在焦點(diǎn)處為105dB（零延遲以下約500μm），樣品處的入射光功率約5mW。樣品臂掃描振鏡前放置一個(gè)液體變焦鏡頭（EL-10-30 series, Optotune Inc.）和一個(gè)10倍物鏡，有效焦距18mm，用于將OCT光束聚焦到皮質(zhì)，獲得的橫向分辨率約11μm，DOF約200μm。液體變焦鏡頭配備-1.5到＋3.5屈光度（dpt）的調(diào)諧范圍和一個(gè)偏置發(fā)散透鏡（f = -150mm）。

 

 

圖1 液體變焦鏡頭的定制SD-OCT系統(tǒng)示意圖。SLD，超發(fā)光二極管；PC，偏光鏡控制器；ETL，液體變焦鏡頭。插圖為一個(gè)鏡頭調(diào)整周期內(nèi)，小鼠皮質(zhì)的多聚焦平面成像方案。CTX，大腦皮質(zhì)；HP，海馬體。

 

結(jié)果
 

首先測(cè)量集成系統(tǒng)焦點(diǎn)調(diào)整性，通過安裝在線性平移臺(tái)上的光束輪廓儀測(cè)量焦點(diǎn)位移，將聚焦功率設(shè)置為＋0.5和＋1.4 dpt進(jìn)行兩次測(cè)量。繪制出最大強(qiáng)度（光束中心）相對(duì)于沿光束距離的圖像（圖2a）。兩條曲線表明光束的焦點(diǎn)有685 μm的偏移。因此本研究使用的＋0.5到＋2.0 dpt范圍對(duì)應(yīng)約800μm的焦點(diǎn)調(diào)整范圍。加上物鏡的約200μm DOF，一個(gè)液體變焦鏡頭系統(tǒng)將能夠覆蓋小鼠皮質(zhì)的1mm深度。OCT M-scan測(cè)量液體變焦鏡頭的時(shí)間響應(yīng)性，同時(shí)在OCT光束焦點(diǎn)處放置一個(gè)反射鏡，并向液體變焦鏡頭發(fā)送步進(jìn)驅(qū)動(dòng)信號(hào)，從＋0.5到＋1.4 dpt調(diào)整。來自反射鏡的OCT信號(hào)的位置用于表示焦度（圖2b）。測(cè)得調(diào)節(jié)時(shí)間為5.46 ms，動(dòng)態(tài)性能足以用于快速焦點(diǎn)調(diào)整，以滿足在神經(jīng)血管耦合研究中的要求。

 

 

圖2（a）在＋0.5和＋1.4 dpt焦度下測(cè)得的光束強(qiáng)度分布圖，顯示焦點(diǎn)位移。（b）當(dāng)焦點(diǎn)功率從＋0.5到＋1.4 dpt時(shí)液體變焦鏡頭的階梯響應(yīng)。
 

 

選擇三個(gè)月大的雄性C57BL/6小鼠（n=3），進(jìn)行皮質(zhì)腦血流的體內(nèi)擴(kuò)展DOF成像。用異氟醚麻醉動(dòng)物，制作5 × 5 mm顱骨窗口以消除顱骨組織散射對(duì)腦成像結(jié)果的影響。在不同軸向位置連續(xù)進(jìn)行OMAG和DOMAG（Doppler OMAG）。OMAG協(xié)議中，每個(gè)B-scan含400個(gè)A-line掃描，在x軸可達(dá)約2.5mm，血管造影需要重復(fù)8次B-scan，垂直方向采集400個(gè)，y軸可達(dá)約2.5 mm。因此一個(gè)處理過的三維血管造影照片的數(shù)據(jù)立方體由1024×400×400（z-x-y）體素組成。DOMAG協(xié)議中，每個(gè)深度位置采集25個(gè)A-line掃描產(chǎn)生一個(gè)M-scan（z軸）。一個(gè)B-frame有380個(gè)M-scan，x軸上約2.5mm，每個(gè)3D數(shù)據(jù)集有300個(gè)B-frame。因此一個(gè)DOMAG數(shù)據(jù)立方體由1024×380×300（z-x-y）體素組成。為描繪-6.1 mm∕s的軸向速度范圍，以3條A-line間隔對(duì)復(fù)合信號(hào)進(jìn)行多普勒處理，以增加有效A-line之間的Δt。使用相位方差掩模從噪聲相位背景中分割出有意義的多普勒血流信號(hào)。

 圖3a-f為一個(gè)調(diào)整周期內(nèi)的6幅OCT結(jié)構(gòu)B-scan圖像，顯示了信號(hào)強(qiáng)度沿皮質(zhì)深度的動(dòng)態(tài)變化。液體變焦鏡頭以0.3 dpt間隔從＋0.5到＋2.0 dpt調(diào)整，因此焦平面從圖3a到3f依次下移。焦平面位置周圍的組織（黃色虛線）反射/散射的光更多，是該區(qū)域的激光功率密度更高所致。從B-scan圖像中提取的A-line強(qiáng)度分布圖（圖3h）也證明了這一點(diǎn)，當(dāng)聚焦平面移動(dòng)得更深時(shí)，更深處皮質(zhì)組織的強(qiáng)度顯著增加。圖像采集后進(jìn)行焦點(diǎn)疊加，簡(jiǎn)而言之，B-scan圖像用一組高斯窗口（圖3a-f白色曲線）掩模，以對(duì)失焦區(qū)域進(jìn)行加權(quán)，然后求和生成圖3g中的合成圖像。合成圖像的軸向強(qiáng)度分布（圖3i）顯示，沿皮質(zhì)深度的OCT信號(hào)強(qiáng)度足夠，在軟腦膜和腦白質(zhì)處有兩個(gè)主要峰值。

 

 

圖3不同焦點(diǎn)下小鼠大腦皮質(zhì)的OCT B-scan描結(jié)構(gòu)圖像。（a–f）從軟腦膜到白質(zhì)（皮質(zhì)表面下0-1000nm）六個(gè)不同焦平面獲得的圖像。黃色虛線表示焦平面中心，白色虛線方塊為DOF區(qū)域。應(yīng)用高斯窗口（白色曲線）過濾出失焦區(qū)域并融合生成（g）。（h）歸一化的軸向強(qiáng)度分布。（i）g中合成圖像的軸向強(qiáng)度分布圖，在軟腦膜和白質(zhì)處發(fā)現(xiàn)兩個(gè)強(qiáng)散射峰。

 

為驗(yàn)證對(duì)整個(gè)小鼠皮質(zhì)中毛細(xì)血管流動(dòng)成像的橫向分辨率，比較了一個(gè)調(diào)整周期中的OMAG B-scan（圖4a-f）和3D正面投影（圖4g-l）。受限于成像物鏡的DOF（約200μm），DOF以外的區(qū)域嚴(yán)重模糊，血管在視覺上變大、無法分辨。用單焦平面模式不可能同時(shí)獲得軟腦膜和深層皮質(zhì)（和白質(zhì)）血流。通過使用高斯窗口的聚焦體積疊加，能夠生成融合的3D體積。與單個(gè)體積相比，多焦平面成像可同時(shí)分辨所有皮質(zhì)深度的毛細(xì)血管流動(dòng)。3D正面圖像（圖4g-l）中也可以看到腦白質(zhì)深度的詳細(xì)的血管特征（圖4l）。這些結(jié)果表明液體變焦鏡頭可以有效擴(kuò)展OCTA的DOF，同時(shí)保持深度皮質(zhì)血流成像的最佳橫向分辨率。
   

 

圖4不同焦平面的OMAG圖像。（a–f）從軟腦膜到腦白質(zhì)六個(gè)不同焦平面獲得的B-scan血流圖像。虛線方塊為200μm DOF區(qū)域，用于制作正面最大強(qiáng)度投影（MIP）圖像，即（g）-（l）。黃色虛線表示B-scan的位置。
 

 

為了顯示聚焦體積疊加方法獲得的血流圖的連續(xù)性，展示了融合3D體積中的5個(gè)連續(xù)OMAG截面（圖5a-e），顯示了整個(gè)皮質(zhì)深度上的擴(kuò)展DOF的血流信號(hào)。5張圖像顯示了跨越六個(gè)拼接體積、垂直連接良好的血流信號(hào)，黃色方塊處甚至可見連續(xù)的穿透血管。

 

 

圖5從多焦平面融合血流體積中選擇的OMAG截面。（a–e）分別對(duì)應(yīng)編號(hào)282-286的B-frame。黃色方塊為連續(xù)的穿透血管。

  最后根據(jù)組織學(xué)，用小鼠S1皮質(zhì)的橫截面組織厚度校準(zhǔn)了成像的軸向深度，并根據(jù)六個(gè)皮質(zhì)層和腦白質(zhì)的軸向位置生成了OMAG和DOMAG正面圖像（圖6a-f）。OMAG用于繪制血管灌注圖，DOMAG用于檢測(cè)血管中紅細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的軸向速度。在高分辨率血液灌注圖和雙向軸向速度圖中，有些血流信號(hào)（青色框）僅在特定皮質(zhì)層中被識(shí)別（圖6d–f）。圖6f清楚地顯示了腦白質(zhì)血液供應(yīng)及其相應(yīng)軸向速度（青色箭頭）。

 

 

圖6不同皮質(zhì)層和腦白質(zhì)的OMAG和DOMAG圖像。每個(gè)圖像都是由DOF區(qū)域的正面MIP投影生成。彩色條表示血流的紅細(xì)胞軸向速度，以±6.1 mm∕s范圍速度向腦深部下行（綠色）或從腦深部上行（紅色）。青色框和箭頭表示在特定層中檢測(cè)到的獨(dú)特血流。

 

 

結(jié)論

 本研究創(chuàng)新地將ETL集成到OCTA中進(jìn)行多焦平面的大腦皮質(zhì)血流成像，通過聚焦體積疊加，成功顯示了從軟腦膜層到腦白質(zhì)的連續(xù)血管圖。證明了在大腦皮質(zhì)深處的腦血流成像中，在OCT/OCTA系統(tǒng)中使用ETL可成功擴(kuò)展DOF。將該系統(tǒng)應(yīng)用于小鼠深層皮質(zhì)功能性血流成像，可便于研究目標(biāo)皮質(zhì)層位置的血流動(dòng)力學(xué)。此外，ETL集成的緊湊性使得它很有潛力結(jié)合到手持或腔內(nèi)OCT探頭中，對(duì)研究和臨床應(yīng)用都會(huì)有巨大幫助。

 本研究使用的液體變焦鏡頭也存在一定局限性，如不考慮快速響應(yīng)和調(diào)節(jié)時(shí)間（5.46ms），OMAG和DOMAG每個(gè)3D數(shù)據(jù)集在每個(gè)焦平面的數(shù)據(jù)采集時(shí)間分別為15s和50s，六個(gè)焦平面可能需要幾分鐘，但通常無法保證這段時(shí)間內(nèi)神經(jīng)狀況和血液動(dòng)力學(xué)狀態(tài)的穩(wěn)定。因此該方法更適合于評(píng)估感興趣的單個(gè)皮質(zhì)層的血流動(dòng)力學(xué)，如大腦功能激活期間最活躍的第四層中的血管通過時(shí)間和不均勻性。此外通過利用高速掃頻源，還可以進(jìn)一步提高系統(tǒng)速度。未來可能在幾分之一秒內(nèi)用動(dòng)態(tài)聚焦進(jìn)行體積血管造影術(shù)。

  參考文獻(xiàn)：Li, Y. , et al. "Electrically tunable lens integrated with optical coherence tomography angiography for cerebral blood flow imaging in deep cortical layers in mice." Optics Letters 44.20(2019):5037.