皮膚輻射損傷（CRI）是由暴露于高劑量電離輻射（IR）引起的皮膚損傷。由于最初的臨床潛伏期和隨后的炎癥爆發(fā)，導(dǎo)致CRI的診斷和治療較為困難。因此臨床癥狀出現(xiàn)前早期檢測CRI將有助于有效治療。韓國研究人員JUNGBIN LEE等證明光學(xué)相干斷層掃描血管造影術(shù)（OCTA）可以非侵入性地檢測CRI小鼠模型潛伏期內(nèi)的皮膚變化。通過暴露于各種紅外劑量在小鼠后肢誘導(dǎo)CRI，通過OCTA縱向成像損傷的皮膚區(qū)域直到臨床癥狀出現(xiàn)。觀察發(fā)現(xiàn)OCTA檢測到皮膚的一些變化，包括皮膚增厚、大血管擴張和血管邊緣不規(guī)則。組織學(xué)研究也證實了OCTA的發(fā)現(xiàn)。表明OCTA可用于早期CRI檢測。研究成果以“Characterization of early-stage cutaneousradiation injury by using optical coherence tomography angiography”為題發(fā)表于Biomedical Optics Express。

  背景

 皮膚輻射損傷（CRI）是暴露于高劑量電離輻射（IR）引起的對皮膚和下層組織的損傷，包括對基底角質(zhì)細胞和毛囊干細胞等連續(xù)分裂細胞的直接損傷，以及隨后的炎癥。臨床中CRI有一個特征，即照射后臨床癥狀延遲發(fā)作，其中的無癥狀期被稱為潛伏期。CRI癥狀在潛伏期后變得明顯，根據(jù)嚴重程度出現(xiàn)紅斑、水腫、色素變化、干燥和潮濕脫屑、潰瘍和壞死等癥狀。除傳統(tǒng)的保守治療外，目前暫無有效的預(yù)防措施或治療方法。這種連續(xù)且不可預(yù)測的炎癥爆發(fā)可導(dǎo)致臨床癥狀診斷和治療滯后。CRI的早期處理有利于減少損傷區(qū)的擴大，提高治療效果。因此對CRI的非侵入性早期診斷似乎是非常重要的。

 光學(xué)成像方法允許對皮膚的局部變化進行非侵入性和敏感的檢測，并且已經(jīng)有各種光學(xué)技術(shù)測試用于早期CRI檢測。3D光學(xué)顯微如反射共聚焦顯微鏡（RCM）和雙光子顯微鏡（TPM）顯示出的潛力可通過觀察潛伏期的細胞變化來進行早期檢測。有研究在急性放射性皮炎出現(xiàn)臨床癥狀之前，使用RCM檢測到皮膚真皮中的海綿樣增生、胞吐和炎性細胞浸潤。此外使用RCM和TPM在CRI小鼠模型的臨床潛伏期都檢測到表皮細胞和皮脂腺的損傷。雖然顯微技術(shù)的檢測靈敏度很高，但視野（FOV）相對較小，實際情況中的篩查范圍可能受到限制。受損皮膚中負責氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)和其他分子向組織的運輸和交換的微循環(huán)也會受到CRI影響。高光譜成像（hyperspectral imaging, HIS）和散射光譜法（diffuse optical spectroscopy）可在臨床潛伏期檢測到脈管系統(tǒng)的灌注和氧合的變化。激光多普勒血流計可測量由CRI引起的血液灌注變化。這些方法測量了與CRI相關(guān)的脈管系統(tǒng)的功能變化。而光學(xué)成像方法通過血管可視化，能夠評估血管的形態(tài)變化。光學(xué)相干斷層掃描血管造影術(shù)（OCTA）可以基于光反射實現(xiàn)無創(chuàng)地觀察皮膚的微觀結(jié)構(gòu)和脈管系統(tǒng)，已經(jīng)在各種皮膚病學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用。有研究利用OCTA發(fā)現(xiàn)皮膚厚度和血管密度增加是對紫外線輻射的急性反應(yīng)。OCTA在患有銀屑病、慢性移植物抗宿主病和硬皮病等病理狀況的參與者中觀察到了毛細血管水平的血管和結(jié)構(gòu)變化。使用OCTA進行過的CRI研究包括檢測全身γ射線照射后早期，小鼠耳廓脈管系統(tǒng)的退化和再生。

 本項研究使用OCTA在局部照射小鼠模型的CRI早期階段觀察皮膚的結(jié)構(gòu)和血管變化。在小鼠后肢上以不同劑量照射：0 Gy（對照）、10 Gy、20 Gy和40 Gy，并通過OCTA縱向成像照射的皮膚區(qū)域，直到出現(xiàn)臨床癥狀。與明場成像和組織學(xué)結(jié)果比較，對皮膚的變化進行了定性和定量分析。

 結(jié)果
 01-CRI小鼠后肢皮膚的縱向明場成像
 

用明視野成像技術(shù)縱向觀察CRI無毛小鼠模型的輻照皮膚區(qū)域，在照射后每兩天拍攝一次縱向明場圖像（圖1）�？梢�0Gy（對照）小鼠顯示出正常無毛小鼠皮膚的典型特征：皮膚蒼白，毛發(fā)分布稀疏。而在受照射小鼠從照射后第4天開始出現(xiàn)一些變化。在10Gy組小鼠中，照射后第4天觀察到脫毛，然后沒有進一步的進展。在20 Gy和40 Gy組小鼠中，照射后第4天觀察到脫毛，然后第8天觀察到紅斑和脫皮。40 Gy組小鼠的臨床癥狀比20Gy組小鼠更嚴重。研究認為20Gy和40 Gy組小鼠模型的臨床潛伏期為照射后6天，因為臨床癥狀出現(xiàn)在第8天�；�于明場成像的結(jié)果對照射后前8天進行縱向OCTA成像研究。



 

 

圖1 CRI小鼠后肢皮膚的縱向明場成像圖。圖像下方黑色水平箭頭線表示臨床診斷及損傷進展。照射后第8天的紅框圖像表明臨床可見的CRI階段。

  02-高劑量CRI小鼠潛伏期晚期皮膚的典型OCTA圖像

 CRI小鼠皮膚的縱向明場圖像顯示，20 Gy和40 Gy小鼠的潛伏期均為照射后6天，因此對整個潛伏期進行縱向OCTA成像（圖2）。正面OCTA圖像為MIP圖像，OCTA圖像分別為50-125 μm（真皮淺層）和100-325 μm（真皮深層）不同深度范圍內(nèi)產(chǎn)生�？梢娫�0 Gy（對照）小鼠中，明場圖像和OCT圖像都顯示正常的皮膚結(jié)構(gòu)：明場圖像顯示皮膚蒼白，毛發(fā)稀疏；截面OCT圖像顯示表層高散射的薄薄真皮，及真皮下弱散射的筋膜或肌肉層。真皮中觀察到毛囊和皮脂腺等顯微結(jié)構(gòu)。兩張正面OCTA圖像分別顯示了皮膚真皮淺層和深層的毛細血管/小血管以及相對較大的血管，其中大血管邊緣平滑。在40 Gy組小鼠中，照射后第6天的皮膚明場圖像除顯示脫毛外，沒有太多可見的變化。然而OCTA檢測到皮膚有幾處變化。截面OCT圖像顯示，照射后第6天的皮膚較對照組相比，真皮增厚，反射強度降低。由于皮膚真皮增厚，肌肉和筋膜層出現(xiàn)的深度比對照組更深。正面OCTA圖像顯示與對照組相比，輻射組真皮淺層的小血管變化不大，但真皮深層的大血管變化顯著。大血管擴張，血管邊緣不規(guī)則。不規(guī)則的血管邊緣可能為內(nèi)皮細胞損傷引起的滲漏。此外還有更多的小而扭曲的血管分支。40 Gy小鼠潛伏期晚期的OCTA圖像顯示，潛伏期內(nèi)皮膚存在由CRI引起的結(jié)構(gòu)和血管改變。

 

 

圖2 對照（a-d）和40 Gy輻射（e-h）組小鼠皮膚在潛伏期晚期（照射后第6天）的明場圖像和OCTA圖像。分別為明場圖像、截面OCT圖像、正面OCTA MIP圖像。真皮淺層和深層的OCTA圖像分別用紅色和黑白描繪。截面OCT圖像（b，f）右側(cè)的黑色箭頭線標記皮膚表皮和真皮的平均厚度，紅色箭頭標記真皮底部。40 Gy深層真皮正面OCTA MIP圖像（h）中綠色箭頭為不規(guī)則血管邊界。

 03-臨床潛伏期皮膚厚度的縱向變化

 在潛伏期間，通過縱向OCTA成像詳細分析了CRI小鼠皮膚的變化（圖3）。可見在0 Gy（對照）組小鼠皮膚中，OCT圖像清楚地顯示正常皮膚結(jié)構(gòu)，包括表層高度散射的真皮及下面弱散射的筋膜或肌肉層。由于對當前OCT系統(tǒng)的圖像分辨率來說，小鼠皮膚的表皮太薄，因此OCT圖像中沒有識別最上面的表皮。而在受照射組小鼠皮膚中，10 Gy組小鼠皮膚厚度仍與對照組皮膚厚度大致相同，其余組縱向OCT圖像顯示皮膚真皮增厚。真皮和肌肉層之間的界限清晰可見。


 

圖3 臨床潛伏期CRI小鼠皮膚的縱向截面OCT描圖像。（a-d）分別為0 Gy（對照）、10 Gy、20 Gy和40 Gy組。紅色箭頭標記皮膚真皮底部。比例尺橫向（x）1mm，軸向（z）400μm。

 

在20 Gy和40 Gy小鼠皮膚中，隨著皮膚厚度隨時間增加，真皮中的反射強度逐漸降低，而真皮和肌肉層之間的邊界也隨之變得不那么清晰。但在潛伏期仍然可能找到邊界。在觀察期間對皮膚增厚進行定量分析（圖4）�？梢娫�0Gy（對照）組小鼠中，成像期間皮膚厚度恒定；10Gy組小鼠皮膚厚度與0 Gy小鼠相似，保持不變；然而20 Gy和40 Gy組小鼠中都觀察到皮膚厚度逐漸增加，照射后第4天的皮膚厚度明顯高于同時期的對照組小鼠皮膚。照射后第6天，20 Gy和40 Gy小鼠的皮膚厚度分別約為0Gy小鼠皮膚厚度的1.49倍和1.62倍。皮膚增厚的原因尚不清楚，可能是由于血管損傷和滲漏。但分析結(jié)果表明OCTA可檢測潛伏期CRI的進展情況。



 

 

圖4 截面強度OCT圖像中的皮膚增厚度定量分析。不同顏色分別代表0Gy（黑色）、10Gy（綠色）、20Gy（藍色）和40Gy（紅色）的皮膚厚度。由0 Gy組的平均厚度標準化，統(tǒng)計顯著性：*p ≤ 0.05，**p ≤ 0.01，***p ≤ 0.001，***p ≤ 0.0001。

 
 

04-潛伏期晚期CRI小鼠皮膚的組織學(xué)研究
 為證實OCTA檢測到的結(jié)構(gòu)變化，對CRI小鼠模型的后肢皮膚進行H&E染色（圖5）�？梢�0 Gy（對照）小鼠皮膚的組織學(xué)圖像顯示正常的皮膚結(jié)構(gòu)：薄的表皮和真皮，真皮中規(guī)則分布的毛囊和皮脂腺以及下面的肌肉。10 Gy小鼠皮膚的組織學(xué)圖像也顯示正常皮膚結(jié)構(gòu)，類似于0 Gy（對照）組。20 Gy和40 Gy組小鼠皮膚的組織學(xué)圖像顯示了幾種變化：表皮和真皮均增厚；表皮細胞和皮脂腺及毛囊中的細胞簇受損；真皮內(nèi)有炎性細胞浸潤。隨著照射劑量增加，這些變化更加嚴重。這些組織學(xué)圖像顯示了CRI的細胞變化細節(jié)，并證實了OCTA觀察到的皮膚增厚。



 

 

圖5 潛伏期晚期（照射后第6天）CRI小鼠皮膚的組織學(xué)圖像。黑色箭頭標記出薄表皮和正常皮脂腺。黃色箭頭標記增厚的表皮和部分或完全受損的毛囊和皮脂腺。帶箭頭的黑色虛線表示表皮和真皮的深度范圍。

 

05-潛伏期皮膚脈管系統(tǒng)的縱向變化
 

OCTA在潛伏期后期檢測到的CRI小鼠皮膚的另一個特征是深層真皮中的大血管變化，因此利用縱向OCTA成像技術(shù)對潛伏期大血管的變化進行了詳細監(jiān)測（圖6）。正面OCTA MIP圖像從距離皮膚表面100-325 μm深度范圍手動根據(jù)厚度調(diào)整生成。0 Gy（對照）組小鼠皮膚的OCTA圖像顯示了真皮深層的典型脈管系統(tǒng)。大血管直徑約100μm，血管直徑隨著分支而減小。血管在邊緣筆直光滑。在10Gy組小鼠皮膚中，OCTA圖像顯示與0 Gy（對照）小鼠皮膚中相似的血管形態(tài)。雖然照射后第5天血管分支略有增加，但大血管的直徑和形狀保持不變。在20 Gy和40 Gy組小鼠皮膚中，OCTA圖像檢測到大血管隨時間推移發(fā)生的變化：血管擴張，血管邊緣變得不規(guī)則。隨時間推移小而扭曲的血管分支越來越多。在20 Gy組小鼠皮膚中，照射后第2天大血管表現(xiàn)正常。隨后第3天血管出現(xiàn)擴張和邊界不規(guī)則并持續(xù)發(fā)展。在40Gy組小鼠皮膚中，大血管相對較薄，并在照射后第2天局部擴張，第3天出現(xiàn)更多扭曲的血管，然后在潛伏期晚期出現(xiàn)局部擴張和邊界不規(guī)則性。



 

 

圖6 潛伏期CRI小鼠真皮深層大血管的縱向正面OCTA MIP圖像。圖中相同顏色箭頭代表同一個血管。比例尺1mm。

 

通過分析縱向OCTA圖像來量化40 Gy組小鼠皮膚中大血管的直徑和邊界不規(guī)則性變化（圖7）。圖7a-b和c-d分別為照射后第2天和第6天0 Gy和40 Gy組小鼠皮膚的代表性O(shè)CTA圖像，放大圖像顯示用于分析的大血管。在這兩天，0 Gy小鼠皮膚圖像中的血管看起來都是直的，邊界清晰。另一方面40 Gy組小鼠血管在照射后第2天相對比較直，在第6天變大且不規(guī)則。圖7e和f為潛伏期期間血管直徑和邊界不規(guī)則性的分析結(jié)果。40 Gy組小鼠中，照射后第6天皮膚中大血管的平均直徑為照射后第2天的1.43 ± 0.05倍。在0 Gy小鼠皮膚中，代表血管邊界不規(guī)則性的變異系數(shù)約為0.14。40 Gy組小鼠皮膚中血管邊界變異系數(shù)隨時間增加，與0 Gy小鼠皮膚相比，照射后第6天明顯升高（0.23）。分析結(jié)果表明，40 Gy組小鼠皮膚在潛伏期內(nèi)大血管的直徑和邊界不規(guī)則性均發(fā)生顯著變化，并且OCTA可以檢測到血管的變化。

 

 

圖7 潛伏期不同時間點0 Gy和40 Gy組小鼠大血管的OCTA圖像以及血管變化的定量分析。作圖分別為照射后第2天和第6天0 Gy組（a，b）和40 Gy組（c，d）小鼠中的大血管OCTA圖像。在這兩天檢測到的相同血管用綠色虛線框標出。（e）輻照后第6天大血管相對于第2天的相對直徑。（f）血管邊緣不規(guī)則。統(tǒng)計顯著性：**p ≤ 0.01，***p ≤ 0.001，****p ≤ 0.0001。

結(jié)論
 

本研究使用OCTA描述CRI小鼠最初潛伏期皮膚的結(jié)構(gòu)和血管的變化。用不同劑量進行局部照射并進行縱向OCTA成像。觀察到在潛伏期，20 Gy和40 Gy高劑量輻射暴露使小鼠模型的皮膚發(fā)生了一些變化，如皮膚增厚、大血管擴張和血管邊緣不規(guī)則。而10Gy低輻射劑量暴露的皮膚中沒有觀察到這種變化。定量分析發(fā)現(xiàn)在20 Gy和40 Gy小鼠皮膚中，從輻照后第4天開始皮膚增厚變得顯著，照射后第6天的皮膚分別比對照組小鼠厚約1.49倍和1.62倍。在照射后第2-4天局部觀察到大血管的擴張和不規(guī)則的血管邊界，然后擴散到更多的大血管。組織學(xué)研究也證明了皮膚增厚。展現(xiàn)出OCTA在檢測結(jié)構(gòu)和血管變化方面的優(yōu)勢，即高成像速度和可深入皮膚真皮的高成像深度。

 雖然本研究存在一定局限性，如目前研究發(fā)現(xiàn)的特征可能不適用于人類受試者。但測得的真皮衰減數(shù)據(jù)可以作為早期CRI檢測的一個特征。此外，OCTA的成像速度還可以提高，利用OCTA檢測CRI皮膚中功能性的微結(jié)構(gòu)和脈管系統(tǒng)變化，如氧飽和度、氧血紅蛋白和脫氧血紅蛋白濃度等。結(jié)合OCTA成像和光譜成像方法的多模態(tài)成像可用于將脈管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能變化相關(guān)聯(lián)，以實現(xiàn)精確和早期檢測CRI 。

 總之，作為一種潛在的早期檢測方法，OCTA在出現(xiàn)臨床癥狀之前，在暴露于高劑量輻射的小鼠皮膚中檢測到皮膚增厚和大血管的變化。對這些變化進行定性和定量分析，并用明場成像和組織學(xué)進行了驗證。表明OCTA對CRI的早期變化敏感，可作為一種良好的早期檢測方法。

 

 

參考文獻：Lee, J. , et al. "Characterization of early-stage cutaneous radiation injury by using angiographic optical coherence tomography." Biomedical Optics Express 11.5(2020).