生物組織中，近紅外波長較長通常散射較少，水吸收較多。加利福尼亞大學(xué)研究人員Jun Zhu等展示了一個以2.1 μm為中心的光學(xué)相干斷層掃描（OCT）系統(tǒng)，其帶寬落在2.2 μm的水吸收光學(xué)窗口內(nèi)，用于嚙齒動物大腦的體內(nèi)成像。成像結(jié)果顯示，使用2.1 μm光在顱骨中的OCT信號衰減實(shí)際上比1.3 μm更少，并且對多次散射拖尾也不太敏感。此外2.2 μm窗口能夠直接光譜OCT評估組織含水量。因此通過進(jìn)一步優(yōu)化，2.2 μm OCT將在低含水量組織（如骨）以及可能進(jìn)行廣泛平均以補(bǔ)償吸收損失的應(yīng)用中具有優(yōu)勢。文章以“Noninvasive, invivo rodent brain optical coherence tomography at 2.1 microns”為題發(fā)表于Optics Letters。
 

 

背景
 

以高分辨率更深入地觀察生物組織是生物光子學(xué)的基本目標(biāo)。然而，組織對光的散射和吸收限制了成像深度的發(fā)展。波長較長，散射系數(shù)（μ_s）降低，而吸收系數(shù)（μ_a）通常會增加。已知水局部地吸收落在位于1.05、1.3、1.7和2.2 μm附近的近紅外光學(xué)窗口內(nèi)。在光學(xué)相干斷層掃描（OCT）中，更傾向于使用長波長，即使水吸收更高，但散射更少，意味著檢測到的OCT信號比例更高，通常OCT使用的是1.3 μm窗口。1.7 μm雖然使用頻率較低，但它散射更低，并且在腦等組織的深度顯微鏡檢查中，衰減系數(shù)最低。由于光源限制和高吸水性，2.2 μm左右的光學(xué)窗口更少用于組織成像。與其他組織相比，骨是一種具有中等質(zhì)量含水量（12%）的生物組織，尚未探究過2.2 μm在體內(nèi)成像骨組織中是否具有優(yōu)勢。
 

本研究描述使用2.1 μm OCT進(jìn)行嚙齒動物腦活體無創(chuàng)成像。發(fā)現(xiàn)在顱骨內(nèi)2.1 μm光的衰減實(shí)際上低于傳統(tǒng)的NIR窗口1.3 μm的衰減。進(jìn)一步使用2.1 μm透過完整顱骨對大鼠進(jìn)行皮質(zhì)OCT血管造影。除預(yù)期的多次散射光減少之外，更重要的是發(fā)現(xiàn)2.2 μm光譜窗口在體內(nèi)OCT中的額外優(yōu)勢：骨衰減更低，并可以直接光譜評估含水量。
 

2.1 μm OCT系統(tǒng)配置如圖1A所示。超連續(xù)譜光源（SuperK EXR20，NKT Photonics）經(jīng)兩個帶通濾波器（BBP-1615–2280，Spectrogon；FB2250–500，Thorlabs，Inc.）過濾后，通過反射準(zhǔn)直器（RC02，Thorlabs，Inc .）耦合到定制的50/50 SM2000光纖耦合器（Thorlabs，Inc.）中。在樣品臂中，光束由反射準(zhǔn)直器（RC04，Thorlabs，Inc.）準(zhǔn)直，經(jīng)2D檢流計(jì)（GVS002，Thorlabs，Inc.）掃描，通過掃描透鏡（LSM02或LSM03，Thorlabs，Inc.）聚焦到樣品上。在參考臂中，由一個改變參考功率的可調(diào)光闌和一個玻璃板補(bǔ)償樣品臂色散。來自樣品的反向散射光和來自參考鏡反射的光由光纖耦合器重新組合，并轉(zhuǎn)給定制的光譜儀。在光譜儀中，光束經(jīng)90°離軸拋物面鏡（MPD249-P01，Thorlabs，Inc.）準(zhǔn)直，由衍射光柵（刻線數(shù)600條/mm，Wasatch Photonics）散射，由150 mm有效焦距長度消色差雙合對（Thorlabs，Inc .）聚焦，并由擴(kuò)展InGaAs線陣相機(jī)（SU1024LDH-2.2RT，Sensors Unlimited）檢測。相機(jī)由外部觸發(fā)并與2D檢流計(jì)掃描同步。數(shù)據(jù)通過幀抓取器（PCIe-1427，NationalInstruments Corp.）來收集。所有的硬件控制都是由一個定制的LabVIEW程序執(zhí)行的。光譜儀的光譜范圍為1990–2210 nm（圖1B）。在成像范圍的前半部分，靈敏度衰減小于5 dB（圖1C）�？諝庵袦y得的軸向分辨率為18.6 μm（水中為14.0 μm）（圖1D）。獲得的樣品的1/e²橫向分辨率為16/32 μm（LSM02/LSM03）。4.3 mW入射功率和14.1 μs（47 kHz掃描速度）相機(jī)曝光時間下，最大靈敏度約84 dB。
 

系統(tǒng)噪聲源可通過改變攝像機(jī)捕獲的參考功率/光電子數(shù)來表征。對于線陣相機(jī)中的每個像素，總噪聲與檢測到的光電子數(shù)之間的關(guān)系用二次函數(shù)擬合，二階非線性項(xiàng)、一階線性項(xiàng)和常數(shù)項(xiàng)分別指定為過量噪聲、散粒噪聲和檢測器噪聲。當(dāng)相機(jī)以�。�1.25Me^-）/大（12.5Me^-）滿阱容量（FWC）和短（14.1 μs，47 kHz）/長（79.9 μs，12 kHz）曝光時間模式運(yùn)行時，分析了相對于散粒噪聲極限（SNL）的系統(tǒng)靈敏度（圖1E）。相對于SNL的最大系統(tǒng)靈敏度約為3.2%，受高探測器噪聲和光源過量噪聲的限制（圖1F）。

 

 

圖1 （A）2.1 μm OCT系統(tǒng)示意圖。（B）水中不同深度的光譜，參考光譜0 μm，（C，D）靈敏度衰減和軸向分辨率與色散補(bǔ)償深度的關(guān)系。（E）不同相機(jī)操作模式下，系統(tǒng)靈敏度與散粒噪聲極限的關(guān)系。（F）使用小FWC、長EXP模式的不同噪聲源的貢獻(xiàn)。

  結(jié)果
 選擇Long-Evans（1-2號）和Sprague-Dawley（3-5號）大鼠（雄性，200-300g，Charles River），用異氟烷（1.5-2.5% v/v）在80%醫(yī)用空氣和20%氧氣的氣體混合物中麻醉，并在實(shí)驗(yàn)過程中連續(xù)輸送。麻醉后，將大鼠固定在立體定向框架內(nèi)（Stoelting Co.）。小心取下頭皮，保持頭骨完好無損。用強(qiáng)力膠（Vibra-Tite）將蓋玻片固定在顱骨上，成像視野為2 × 2 mm²/2.5× 2.5 mm²。使用掃描透鏡LSM02/LSM03時，入射樣品功率為3.5/4.3 mW。對采集的條紋進(jìn)行重采樣、分配補(bǔ)償和傅里葉變換，得到復(fù)雜的OCT數(shù)據(jù)。為提供兩個光學(xué)窗口的內(nèi)在比較，不考慮OCT系統(tǒng)的性能，對強(qiáng)度（復(fù)數(shù)據(jù)的模平方）圖像進(jìn)行了深度相關(guān)噪聲背景和靈敏度下降的校正�；�于分割的顱骨表面，每個亞位置內(nèi)的體積數(shù)據(jù)被展平，然后橫向平均以產(chǎn)生線輪廓。對于定量衰減系數(shù)分析，假設(shè)n_skull = 1.5和n_cortex = 1.33的折射率。
 在同一只大鼠中，通過順序獲得的1.3 μm和2.1 μm OCT顱骨和皮層的截面圖像（圖2A，B；n = 1.33），說明了顱骨與大腦的衰減特征不同（圖2C）。然后將視場分為九個子區(qū)域進(jìn)行總衰減系數(shù)測量，共焦門控的計(jì)算如下:
其中z是深度，I（z，λ）表示OCT線輪廓，z₀（λ）是高斯光束瑞利范圍，z_cf（λ）表示光束腰的深度位置，設(shè)置為近似聚焦位置。OCT信號衰減用指數(shù)衰減項(xiàng)來描述，其中因子2表示雙程衰減，C是常數(shù)。比較了三只大鼠跨27個子區(qū)域的淺層皮層I（圖2C綠色陰影區(qū)域）中的衰減系數(shù)（圖2D）。two-way ANOVA確定統(tǒng)計(jì)顯著性。在顱骨中，由于散射較低，2.1 μm OCT信號比1.3 μm衰減得慢（P < 0.001），而在含水量高的皮層I中，2.1 μm的衰減系數(shù)更大（P < 0.001）。
 還注意到，在1990-2210 nm光譜范圍內(nèi)，吸水率顯著降低。如果散射得到適當(dāng)?shù)奶幚恚�這一特征可以實(shí)現(xiàn)水體積分?jǐn)?shù)的光譜評估（與水含量成比例）。因此，將光譜分成7個子帶，中心波長分別為2009、2037、2065、2094、2123、2154和2186nm，半峰全寬約為36nm。在成像視場的每個子區(qū)域中，背景和靈敏度滾降被校正，然后用共焦門控和單次散射的組合模型擬合局部平坦且橫向平均的OCT信號，  這里，子帶之間的色焦移包含在z_cf （λ）中。衰減系數(shù)μ_t （λ）是散射衰減[μ_t,s（λ）= A（λ/500）^-b]的和，與μ_s不同，它包括多重散射效應(yīng)和水吸收[f_wμ_a,w （λ）]，其中b是散射功率，f_w是水的體積分?jǐn)?shù)。由于b依賴于樣本且先驗(yàn)未知，因此它被順序固定在從0到1.5的假設(shè)值，而C、f_w和A使用非線性最小二乘回歸對每個假設(shè)b進(jìn)行擬合。

 

圖2 使用（A）1.3μm和（B）2.1μm系統(tǒng)的大鼠頭蓋骨和皮質(zhì)的截面圖像。（C）組織OCT信號線輪廓，綠線界定顱骨和皮質(zhì)層Ⅰ的邊界（糖尿病，硬腦膜）。綠色陰影區(qū)域代表皮質(zhì)層Ⅰ的擬合范圍。（D）1-3號大鼠的平均組織衰減系數(shù)（平均標(biāo)準(zhǔn)偏差）。水平線表示由two-way ANOVA確定的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。
 

基于上面公式中的模型估計(jì)水體積分?jǐn)?shù)（f_w）（圖3）。為了首先評估該方法，進(jìn)行了離體模型實(shí)驗(yàn)。圖3A顯示了在25%（v/v）脂肪乳劑-20（IL-20）溶液（去離子水稀釋）的每個子帶中歸一化OCT信號的擬合。假設(shè)散射功率為0.5，擬合的總衰減系數(shù)（圖3B中的紅色）遵循整個光譜的吸水性（藍(lán)色虛線），表明含水量高。衰減主要由吸收[f_wμ_a,w（λ）]（藍(lán)色），而不是散射[μ_t,s（λ）= A（λ/500）^-b]（綠色）。由于假設(shè)的b值從0到1.5不等，IL-20溶液的估計(jì)f_w從94.1到91.5%不等（圖3C），接近94.3%[0.25 ×（ 1–22.7%）+0.75]的估計(jì)值，假設(shè)純IL-20中散射粒子的體積分?jǐn)?shù)為22.7%。圖3D顯示了歸一化的OCT信號在干式光學(xué)漫射器（WS-1，Ocean Optics）每個子帶中的擬合。假設(shè)散射功率為0.5，擬合的衰減系數(shù)（圖3E）在整個光譜范圍內(nèi)變化很小，表明含水量較低。由于假設(shè)的b值從0變化到1.5，估計(jì)的f_w在9.8-6.5%變化（圖3F）。擬合程序返回非物理負(fù)f_w值，以補(bǔ)償較大假設(shè)b的較大衰減變化。
 

給定這些在人體模型中的合理結(jié)果，然后我們在體內(nèi)分割和分析大鼠顱骨和大腦皮層Ⅰ，應(yīng)用公式2中的模型，并假設(shè)在該波長范圍內(nèi)，水是顱骨和皮層中的主要吸收劑。在體內(nèi)分析中，最長波長子帶被丟棄，因?yàn)槠べ|(zhì)靈敏度差，受探測器量子效率的限制。大鼠顱骨（圖3G）和表層皮質(zhì)層I（圖3J）中的標(biāo)準(zhǔn)化體內(nèi)OCT信號的擬合表明，假設(shè)合理的散射功率為0.5，顱骨（圖3H）中頻譜的擬合總衰減系數(shù)比層I（圖3K）中的變化小，表明顱骨中的含水量較低。因此，體內(nèi)擬合（圖3I和3L）估計(jì)，皮質(zhì)層I與顱骨相比具有更高的水體積分?jǐn)?shù)（60-70%）（~ 20%）。

 

 

圖3 基于吸收的水體積分?jǐn)?shù)的光譜測量。（A，D，G，J）25%（v/v）IL-20溶液、干式光學(xué)擴(kuò)散器、顱骨和大腦（大鼠#2）的歸一化OCT子帶線輪廓。線條輪廓擬合（黑色實(shí)線）基于等式（2）。（B，E，H，K）波長相關(guān)的擬合衰減系數(shù)（μ_t）（紅色）確定為擬合吸收衰減（f_wμ_a,w）（藍(lán)色）和擬合散射衰減（μ_t,s）（綠色）之和，假設(shè)散射功率b為0.5。純水吸收（μ_a,w）以供參考（藍(lán)色虛線）。（C、F、I、L）估計(jì)的水體積分?jǐn)?shù)（f_w）弱依賴于假設(shè)的b。

 

通過1.3 μm和2.1 μm系統(tǒng)獲得的大鼠頭蓋骨和皮質(zhì)的正面血管造影照片（圖4A，B；n = 1.33用于圖像顯示）是相似的。由于橫向分辨率（分別為15μm和16μm）非常接近，盡管2.1μm OCT系統(tǒng)的性能不是最佳的，但成像質(zhì)量顯著具有可比性。為評估多次散射，在對血管造影照片進(jìn)行局部平坦化和平均化之后，在圖4C中比較了來自1.3和2.1 μm處的橙色感興趣區(qū)域的歸一化顱骨血管線輪廓。在線輪廓中，血管管腔從60到30 μm，而多重散射拖尾開始于30μm左右�？傮w而言，在六個相似的ROI中，2.1 μm的拖尾幅度比1.3μm的低41±9%。此外，2.02–2.12μm子帶中血管造影的顱骨血管線輪廓相似（圖4D），表明水吸收不是主要影響因素。相反，2.1μm附近的較低散射可能解釋了較低的拖尾幅度。在2.1μm（圖4E–4G）對2號和4–5號大鼠進(jìn)行的深度彩色編碼正面血管造影顯示，硬腦膜上方的顱骨血管為藍(lán)色，皮質(zhì)血管為紅色（與硬腦膜的距離用n_skull= 1.5和n_cortex= 1.33計(jì)算）。表層皮質(zhì)脈管系統(tǒng)通過完整的顱骨被分解。

 

 

圖4 由（A）1.3 μm和（B）2.1 μm OCT系統(tǒng)獲得的大鼠頭蓋骨和皮質(zhì)的正面血管造影照片。（C）感興趣區(qū)域（橙色方框）中的顱骨血管線輪廓在2.1μm時顯示出尾部變小，這由ROI內(nèi)兩個波長的橫截面血管造影照片所證實(shí)（插圖）。（D）ROI內(nèi)的子帶顱骨血管線輪廓在2.02-2.12μm之間相似，如ROI內(nèi)的截面血管造影照片所示（插圖）。（E–G）深度（到硬腦膜的距離）編碼的不同顱骨厚度的大鼠（大鼠#2和# 4–5）正面血管造影照片。請注意，在C和D中，假設(shè)折射率為n = 1.33，而在E–G中，n_skull = 1.5，n_cortex = 1.33。

 目前，由于探測器和光源噪聲，系統(tǒng)靈敏度非常有限。此外，并非所有使用的光學(xué)元件都針對2.1 μm進(jìn)行了優(yōu)化，這進(jìn)一步降低了靈敏度。例如，樣本臂中的掃描透鏡（LSM02/LSM03）有64%/42%的雙程損耗。定制光學(xué)系統(tǒng)將提高最大靈敏度。靈敏度也可以通過具有較低損耗和雙平衡檢測的掃頻源系統(tǒng)來提高。一個散粒噪聲受限的低損耗系統(tǒng)可以達(dá)到100 dB以上的靈敏度。對于顱骨含水量，膠原蛋白吸收的潛在作用值得進(jìn)一步研究。此外，60-70%的皮質(zhì)水體積分?jǐn)?shù)略低于預(yù)期。將來，加權(quán)吸水系數(shù)以說明每個子帶的有限光譜寬度可以提高定量精度。關(guān)于散射功率的更好的先驗(yàn)信息也將提高精度。

  結(jié)論

 本文證明了一種在2.2 μm光譜窗口工作的新型OCT系統(tǒng)被證明可用于嚙齒動物大腦的無創(chuàng)體內(nèi)成像。盡管由于水吸收較高，2.2 μm通常不用于生物成像，但本文的體內(nèi)研究顯示，對于骨這種低含水量的生物組織，2.1 μm實(shí)際上具有比1.3 μm更低的OCT衰減。盡管系統(tǒng)性能有限，但2.2 μm窗口的內(nèi)在優(yōu)勢得到了確認(rèn)，包括顱骨衰減更低、對多次散射的免疫力更強(qiáng)以及用光譜定量組織含水量的能力，在相關(guān)研究中可能發(fā)揮出意想不到的效果。


  參考文獻(xiàn)：Zhu, Jun , et al. "Noninvasive, in vivo rodent brain optical coherence tomography at 21 microns." Optics Letters 44.17(2019):4147.