美國斯坦福大學(xué)的駱利群課題組于2020年12月17日在Cell上發(fā)表了題為“Differential encoding in prefrontal cortex projection neuron classes across cognitive tasks”的文章，在這項(xiàng)研究中，作者研究特定轉(zhuǎn)錄類型的小鼠PFC神經(jīng)元與軸突投射和編碼特性在多個(gè)認(rèn)知任務(wù)中的關(guān)系，提出大多數(shù)神經(jīng)元類型靶向多個(gè)靶點(diǎn)投射，且大多數(shù)靶點(diǎn)接受多種類型神經(jīng)元的投射。通過使用滔博生物-Inscopix自由活動(dòng)鈣成像顯微鏡發(fā)現(xiàn)在自由活動(dòng)的小鼠中進(jìn)行“二選一”任務(wù)測(cè)試時(shí)，這些神經(jīng)元中存在的任務(wù)相關(guān)信號(hào)的多樣性。
 
摘要
正文
     為了確定轉(zhuǎn)錄組類型并揭示PFC區(qū)域基因表達(dá)的潛在差異，研究人員分析了背內(nèi)側(cè)區(qū)（dmPFC）、腹內(nèi)側(cè)區(qū)（vmPFC）和眶額區(qū)（OFC）。首先，將Rbp4Cre與在Cre+細(xì)胞中表達(dá)tdTomato的小鼠雜交，雙轉(zhuǎn)基因后代從出生后第34天到第40天分離組織，并運(yùn)用SMART-Seq2對(duì)tdTomato+細(xì)胞進(jìn)行熒光激發(fā)細(xì)胞分類（FACS）和基于平板（plate-based）的scRNA-seq，共分析了來自三個(gè)區(qū)域的3139個(gè)細(xì)胞的。隨后，用基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的熒光原位雜交（HCR-FISH）檢查了PFC轉(zhuǎn)錄組類型之間標(biāo)記表達(dá)的空間位置和共標(biāo)狀況，發(fā)現(xiàn)dmPFC和vmPFC的轉(zhuǎn)錄組的空間相似，區(qū)分OFC的主要區(qū)別在于Pld5和Cxcr7（5-2）簇細(xì)胞的富集（圖2）。
    為了研究vmPFC投射神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄組類型與特定靶點(diǎn)之間的關(guān)系，研究人員對(duì)小鼠注射逆行Cre表達(dá)病毒，通過解剖含有逆行標(biāo)記tdTomato+細(xì)胞的vmPFC并運(yùn)行scRNA-seq后發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)投射定義的細(xì)胞群體由多種轉(zhuǎn)錄組組成，且每個(gè)轉(zhuǎn)錄組類型共同投射到多個(gè)區(qū)域（圖3）。例如，97%以上的vmPFC→PAG神經(jīng)元映射到Npr3簇，雖然將這些群體稱為“PAG投射”，但是，PAG并非特定靶點(diǎn)，即vmPFC→PAG神經(jīng)元會(huì)將側(cè)支延伸到多個(gè)皮質(zhì)下靶點(diǎn)。緊接著，對(duì)PAG或cPFC投射的tdTomato+神經(jīng)元進(jìn)行切片染色，對(duì)上述部分觀察結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示cPFC投射神經(jīng)元與標(biāo)記物Cd44、Cxcr7和Figf而不與Npr3共同標(biāo)記，比例與測(cè)序數(shù)據(jù)中基本一致，相反的，PAG投射神經(jīng)元與Npr3而非Figf高頻率共同標(biāo)記。因此，這部分研究分別通過轉(zhuǎn)錄組和投射信號(hào)分析了不同的神經(jīng)元群體。
    接下來，研究人員對(duì)自由活動(dòng)的小鼠實(shí)施“二選一（two-alternative forced choice, 2AFC）”任務(wù)，訓(xùn)練小鼠在中心端口區(qū)分兩個(gè)氣味提示，當(dāng)移至正確端口時(shí)獲取4μl水獎(jiǎng)勵(lì)，移至錯(cuò)誤端口則會(huì)導(dǎo)致短暫的吹氣處罰（圖4）。通過Inscopix頭戴式自由活動(dòng)顯微鈣成像系統(tǒng)記錄分析單個(gè)細(xì)胞水平的神經(jīng)活動(dòng)來探索不同的vmPFC細(xì)胞類型如何對(duì)決策制定的功能做出貢獻(xiàn)（圖5），并通過光遺傳刺激皮層抑制神經(jīng)元，使特定皮層區(qū)域沉默，測(cè)試vmPFC的神經(jīng)活動(dòng)對(duì)任務(wù)表現(xiàn)是否重要。研究人員在所有皮層GABA能抑制神經(jīng)元中均表達(dá)ChR2的Gad2Cre；Ai32雙轉(zhuǎn)基因小鼠的vmPFC上方植入雙側(cè)光纖，結(jié)果顯示vmPFC對(duì)于2AFC任務(wù)的正確執(zhí)行是必需的。
    那么不同類型的vmPFC投射神經(jīng)元如何編碼任務(wù)相關(guān)信號(hào)呢？研究人員將上述試驗(yàn)任務(wù)定義為“Approach-Decision-Lick-Reward”四個(gè)階段，通過在Cre依賴的GCaMP6f小鼠中使用自由活動(dòng)顯微鈣成像記錄以量化不同任務(wù)階段所有成像細(xì)胞的比例（圖5）。結(jié)果顯示60%-80%的細(xì)胞都至少在一個(gè)階段活性增高（圖6），例如，在“Decision”階段，與cPFC投射神經(jīng)元相比，PAG投射神經(jīng)元和Rbp4Cre標(biāo)記的類別活化的細(xì)胞比例更高；相反，在“Reward”階段，與Rbp4Cre相比，PAG和cPFC投射神經(jīng)元活化的細(xì)胞比例較低。值得注意的是，許多vmPFC細(xì)胞不僅對(duì)任務(wù)階段表現(xiàn)出活動(dòng)選擇性，而且對(duì)左或右的方向也有選擇性，而對(duì)于方向選擇性PAG投射神經(jīng)元中包含大多數(shù)特定于選擇方向的信息。
    研究人員在原有試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改動(dòng)，小鼠需要正確辨別出四種可能氣味來獲取獎(jiǎng)勵(lì)，隨后會(huì)切換到無氣味提示任務(wù)，這也是本研究的關(guān)鍵特征，即對(duì)跨多個(gè)任務(wù)的行為編碼的探究。發(fā)現(xiàn)PAG投射神經(jīng)元主要表示編碼氣味提示任務(wù)中的選擇性，但在切換到無提示任務(wù)時(shí)小鼠會(huì)花費(fèi)數(shù)十秒迅速適應(yīng)，而cPFC投射神經(jīng)元?jiǎng)t主要參與獎(jiǎng)賞相關(guān)任務(wù)。這提示不同的細(xì)胞類型如何在不同的任務(wù)中發(fā)揮作用，并強(qiáng)調(diào)了在測(cè)試特定于細(xì)胞類型的編碼時(shí)具有多樣化的行為庫的重要性。

    總的來說，這項(xiàng)工作通過scRNA-seq數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)對(duì)認(rèn)知任務(wù)中編碼特性的分析，彌合了分子和系統(tǒng)神經(jīng)科學(xué)間的重要鴻溝，進(jìn)一步加深對(duì)PFC功能的理解，并推斷了任務(wù)信息如何在細(xì)胞類型框架中組織的原理。

參考文獻(xiàn):
Jan H. Lui, Liqun Luo, et al. Differential encoding in prefrontal cortex projection neuron classese across cognitive tasks. Cell(2020)

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