本文要點：食品添加劑在食品生產(chǎn)中是必不可少的，在食品加工或準備過程中亞硝酸鹽（防腐劑）和胺會反應生成亞硝胺，亞硝胺是一種劇毒物質(zhì)已知會引起肝毒性甚至癌癥。準確檢測亞硝胺導致的急性肝損傷有助于制定最佳治療方案，避免病情進一步惡化。本文開發(fā)了一種可激活的探針BHC-LUT，在原位肝臟生物標志物H2O2的觸發(fā)下，可以釋放藥物木犀草素進行治療，同時形成生色團（BHC-OH）用于NIR-II熒光成像和多光譜光聲層析（MOST）成像。

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以苯并吲哚七甲基菁為生色團骨架，在苯并吲哚基團上引入三甘醇，提高探針的水溶性和生物相容性；通過硼酸鍵將木犀草素偶聯(lián)到發(fā)色團上，其中硼酸既是H2O2的響應基團，又是熒光的淬滅劑。當探針BHC-Lut通過靜脈注射到DEN誘導肝損傷的小鼠體內(nèi)，此時小鼠肝臟中存在H2O2，探針BHC-Lut中硼酸識別到H2O2，釋放出藥物木犀草素進行治療，同時釋放出熒光團BHC-OH用于NIR-II熒光成像和MOST成像。
 

圖1. A）探針BHC-Lut（5μM）與H2O2（0、5、10、20、30、45、60和80μM）反應25min前后的吸收光譜。插圖：830 nm處的吸光度與H2O2濃度的函數(shù)關系；B）探針BHC-Lut（20μM）與H2O2（0、50、100、120、200和300μM）反應25min前后的熒光光譜。插圖：930nm處的熒光強度與H2O2濃度的函數(shù)關系；C）探針BHC-Lut（20μM）在不同時間（0、1、3、6、10、15、20和25min）與H2O2（300μM）反應后的熒光光譜。插圖：930 nm處的熒光強度隨時間變化；D）探針BHC-Lut（20μM）的相對OA強度與H2O2水平(0、20、40、80、160、320μM)之間的關系。插圖：探針BHC-Lut與不同水平的H2O2反應后的光聲圖像；E）探針BHC-Lut（10μM）中與不同劑量的H2O2作用不同時間（0，5，10，20，40，60，80min）前后木犀草素的累積釋放百分比；F）探針BHC-Lut（20μM）在不同生物相關物質(zhì)中熒光強度（930 nm）的比率。a.空白，b.H2O2（300μM），c.谷胱甘肽（1mM），d.半胱氨酸（1mM），e. L-異亮氨酸（1mM），f.谷氨酸（1mM），g.酪氨酸（1mM），h.丙氨酸（1mM），i.葡萄糖（1mM），j.精氨酸（1mM），k.NaNO2（1mM），l.NaClO（300μM），m. Na+（1mM），n. K+（1mM），o. Ca2+（1mM），p. Mg2+（1mM）。激發(fā)波長：808 nm

 

首先利用光譜測量研究探針BHC-Lut對于H2O2的光學性質(zhì)。如圖1A和1B所示，在沒有H2O2存在時，探針BHC-Lut的熒光強度是很低的；隨著H2O2的水平增加，探針BHC-Lut的吸光度和熒光強度逐漸增強。另外，隨著探針BHC-Lut與H2O2反應時間增長，熒光強度也隨之增強（圖1C）。如圖1D所示，探針BHC-Lut與不同濃度的H2O2反應，隨著H2O2水平增高，探針BHC-Lut的光聲信號隨著增強。結(jié)果表明探針BHC-Lut可以響應H2O2，并且可以產(chǎn)生用于檢測H2O2的熒光成像和光聲信號。

 

為了評估通過響應H2O2釋放藥物的能力，將不同水平的H2O2與探針BHC-Lut共孵育，在不同時間時評估藥物的累積釋放百分比。如圖1E所示，與100μM H2O2共孵育的探針BHC-Lut將木犀草素快速釋放，而未經(jīng)H2O2處理的探針釋放木犀草素的速度非常慢。接下來進一步研究探針BHC-Lut對H2O2的響應選擇性，將探針BHC-Lut與不同的生物相關物質(zhì)共孵育25min，檢測在930nm處熒光強度的比率。如圖1F所示，與H2O2共孵育的探針BHC-Lut顯示出明顯的熒光增強，相反與其他生物相關物質(zhì)共孵育的探針BHC-Lut只有微小的熒光強度變化，表明探針BHC-Lut具有良好的H2O2響應選擇性。
 

圖2. A）對照組（健康小鼠）和模型組（小鼠分別腹腔注射DEN劑量為50mg kg-1、100mg kg-1 、200mg kg-1）在靜脈注射探針BHC-Lut（2.25 mg kg-1）后不同時間點時（0、15、25、35、45、60 min）的NIR-II熒光成像。對仰臥位的小鼠進行成像。綠色虛線表示肝臟區(qū)域的ROI。激發(fā)光（808nm, 60mW cm-2）。在鹵素光照射下拍攝明場圖像；B）圖2A中ROI的平均NIR-II熒光強度；C）模型組和對照組小鼠10天內(nèi)的相對體重（n=5）

 

為了研究探針BHC-Lut在內(nèi)源性H2O2導致的急性肝損傷中的檢測和成像，首先通過腹腔注射DEN，建立DEN導致小鼠肝損傷的模型，通過注射不同DEN的劑量建造不同程度的肝損傷。通過H&E染色分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，DEN高劑量組小鼠肝細胞空泡腫脹加重，并且隨著DEN劑量的增加肝損傷加重。接著通過熒光成像進一步研究，如圖2A和2B所示，在靜脈注射BHC-Lut25min后，小鼠肝區(qū)域的熒光信號清晰可見，并且隨著時間增長和DEN劑量增多熒光強度逐漸增強。此外，隨著DEN的劑量增多，小鼠相對體重逐漸下降，進一步表明了DEN的毒性（圖2C）。
 

圖3. A）探針BHC-Lut（2.25mg kg-1）靜脈注射0和60min后模型組和對照組的MOST橫斷面成像。脊髓標記為“1”。白色虛線表示肝臟區(qū)域的ROI；B）3A中ROI區(qū)域的平均MOST強度（n=5）；C）模型組和對照組小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）的水平（n=5）；D）探針BHC-Lut（2.25mg kg-1）靜脈注射0和60min后模型組和對照組的3D MOST成像。脊髓標記為“1”。白色虛線表示肝臟區(qū)域

 

接下來通過MOST成像進一步研究探針BHC-Lut在內(nèi)源性H2O2導致的急性肝損傷中的檢測和成像，如圖3A和3B所示，與對照組相比，模型組小鼠在靜脈注射探針BHC-Lut后，隨著時間增長和DEN劑量的增多，MOST強度逐漸增強；注射后60min后，肝臟區(qū)域出現(xiàn)明顯的MSOT信號。圖3C所示的是小鼠ALT的水平，注射高DEN劑量的小鼠ALT水平顯著升高，并且明顯高于對照組，進一步證實了高DEN劑量會導致更嚴重的肝損傷。此外，如圖3D所示，靜脈注射探針BHC-Lut 60min后，高DEN劑量組小鼠肝臟MSOT信號明顯高于對照組。MSOT成像結(jié)果與NIR-II成像結(jié)果一致，證明了急性肝損傷的程度隨DEN劑量的增加而加重。
 

圖4. A）在3次或6次注射治療后，對四組進行NIR-II熒光成像。對照組：健康的小鼠，生理鹽水組：模型小鼠用生理鹽水治療，木犀草素組：模型小鼠用木犀草素（1.02mg kg-1）治療，探針組：模型小鼠用探針BHC-Lut（4.5mg kg-1，相當于1.02mg kg-1的木犀草素）治療。對仰臥位的小鼠進行成像。激發(fā)波長為808nm。綠色虛線表示肝臟區(qū)域的ROI。在鹵素光照射下拍攝明場圖像；B）在3次或6次注射治療后，對四組進行MSOT橫斷面成像。脊髓以“1”表示。對俯臥位的小鼠進行成像。白色虛線表示肝臟區(qū)域的ROI；C）圖4A中第3天或第6天中ROI區(qū)域的平均NIR-II熒光強度（n=5）；D）圖4B中第3天或第6天覆蓋肝臟區(qū)域的ROI的平均MOST強度（n=5）；E）第3天和第6天小鼠的血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平（n=5）

 

為了探討探針BHC-Lut對DEN所致小鼠急性肝損傷的治療作用，通過腹腔注射將DEN （100mg kg-1）注入小鼠體內(nèi)，建立小鼠急性肝損傷模型。如圖4A和4C所示，無論是第3天還是第6天，探針組小鼠的肝臟區(qū)域的NIR-II熒光信號都明顯弱于生理鹽水組和木犀草素組，接近于對照組的NIR-II熒光信號，表明探針BHC-Lut對于肝損傷具有良好的治療效果。之后進行H&E染色的組織學分析和小鼠體重的研究，進一步驗證了探針BHC-Lut對于肝損傷的治療作用。

 

如圖4B和4D所示，相比于生理鹽水組和木犀草素組，探針組小鼠的肝臟區(qū)域的光聲信號明顯較弱，與對照組的光聲信號相近。MOST成像數(shù)據(jù)與NIR-II成像數(shù)據(jù)一致，表明了探針BHC-Lut對于肝損傷具有良好的治療效果。此外，探針組小鼠的ALT水平明顯低于生理鹽水組和木犀草素組，與對照組ALT水平接近（圖4E），進一步驗證了探針BHC-Lut的治療能力。

 

總結(jié)：本文開發(fā)一種可激活的探針，通過對原位肝臟生物標記物H2O2的響應，實現(xiàn)對食物添加劑引起的肝損傷進行NIR-II成像和MOST成像，同時釋放治療藥物木犀草素。探針BHC-Lut不僅可以用于小鼠肝損傷的檢測，而且可以提供對肝損傷的治療。提供了一種治療策略：通過響應生物標記物釋放生色團和藥物，實現(xiàn)對疾病的檢測和治療。

 

參考文獻

https://doi.org/10.1016/j.aca.2022.339831

 

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