柔腦膜側(cè)支狀態(tài)是卒中結(jié)果的獨(dú)立預(yù)測因子。美國和日本的研究人員Atsushi Kanoke等通過光學(xué)相干斷層掃描血管造影術(shù)比較兩種固有柔腦膜側(cè)支化程度不同的小鼠品系（C57BL/6和Balb/C），確定了缺血性卒中后，側(cè)支血流和下游血流動力學(xué)的時空動力學(xué)變化。在C57BL/6小鼠大腦動脈（MCA）閉塞后，立即檢測到了強(qiáng)勁的軟腦膜側(cè)支血流補(bǔ)充，并在7天內(nèi)持續(xù)擴(kuò)張。相比之下Balb/C小鼠中幾乎沒有觀察到側(cè)支補(bǔ)充，同時梗塞面積更大、功能更差。此外卒中后，網(wǎng)狀小動脈（PA）血流量減少了90%以上，Balb/C小鼠的血流量減少更大，恢復(fù)更少，毛細(xì)血管轉(zhuǎn)運(yùn)時間的異質(zhì)性也更長。因此皮質(zhì)卒中后，固有軟腦膜側(cè)支的范圍會影響下游血流動力學(xué)，并對微血管床產(chǎn)生長期影響。

  背景

 Willis環(huán)（CW）和柔腦膜（leptomeningeal, LMA）血管網(wǎng)分別由初級和次級側(cè)支通路構(gòu)成。LMA側(cè)支可能向大腦皮層表面提供雙向動脈血液，連接大腦前動脈（ACA）與大腦中動脈（MCA）、大腦中動脈（MCA）與大腦后動脈（PCA），并在較小程度上連接ACA與PCA。當(dāng)Willis環(huán)下游的大腦動脈突然閉塞時，LMA側(cè)支來補(bǔ)充維持血液供應(yīng)。大量證據(jù)表明，缺血性卒中后的LMA側(cè)支化對卒中結(jié)果預(yù)測起關(guān)鍵作用。因此在急性缺血性卒中患者的治療管理中，常通過神經(jīng)影像技術(shù)評估側(cè)支血流狀態(tài)，該方案ESCAPE臨床證實(shí)過并已經(jīng)成為可靠的決策評估方法。已知年齡、血管風(fēng)險因素和遺傳都會影響側(cè)支的發(fā)育和動態(tài)反應(yīng)，但尚未完全確認(rèn)影響腦血管側(cè)支化的具體因素。

 研究較充分的是遺傳對固有側(cè)支范圍的影響，已被用于預(yù)測MCA卒中后的梗塞體積，通過同源圖確定了Dce1（determinant of collateral extent 1）基因。將Dce1的等位基因?qū)�入Balb/C小鼠基因組中，使軟腦膜側(cè)支范圍較野生型減少了83%，并以等位基因劑量依賴的方式恢復(fù)了腦血流量（CBF），減少了大腦中動脈閉塞（MCAO）后的梗塞體積，證實(shí)了缺血區(qū)域中固有側(cè)支在決定腦血管灌注上的重要性。

 盡管已知在急性缺血性卒中后，固有側(cè)支循環(huán)與腦損傷嚴(yán)重程度存在一定的聯(lián)系，但仍無法解釋LMA側(cè)支系統(tǒng)如何以暫時的方式補(bǔ)償腦血流，如何影響下游小血管中的血液供應(yīng)。之前許多臨床前研究無法評估滋養(yǎng)動脈對缺血性區(qū)域的貢獻(xiàn)，因?yàn)闆]有合適的方法，只能依靠評估整體血液灌注或驗(yàn)尸檢查。本文假設(shè)LMA側(cè)支范圍減少以及先前存在的側(cè)支直徑變小會影響卒中后從軟腦膜血管到微血管床的血液灌注，使用光學(xué)相干斷層掃描血管造影術(shù)（OCTA）評估皮質(zhì)腦血流動力學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證。使用2個固有LMA分支不同的小鼠品系C57BL/6和Balb/C，確定缺血性卒中后LMA吻合周圍的時空動力學(xué)，描述并比較不同的側(cè)支血流對下游網(wǎng)狀小動脈和毛細(xì)血管血流的影響，以及對卒中結(jié)果的影響。



  圖1 OCT系統(tǒng)及OMAG方法示意圖。（a）1310 nm SD-OCT系統(tǒng)。SLD：超發(fā)光二極管；PC：偏振控制器。（b）OMAG掃描方案。一個cluster中進(jìn)行8個連續(xù)掃描，應(yīng)用OMAG算法提取血流信息。（c）3D OMAG體積式en face MIP。（d）DOMAG算法獲得速度B-frame。（e）從DOMAG數(shù)據(jù)產(chǎn)生的雙向軸向速度圖。顏色棒代表紅細(xì)胞的軸向速度，流量下降為陰性呈綠色，流量上升為陽性呈紅色。（f）皮質(zhì)中下降的PA血流（頂部）和上升的小靜脈流（底部）。（g）x-y平面的PA和小靜脈血流信號。

  結(jié)果
 01-固有柔腦膜側(cè)支循環(huán)是卒中后快速逆向血流募集的原因
 

為確定固有側(cè)支如何在空間和時間上影響逆行血流，使用wild field Doppler OCT（DOCT）成像并量化遠(yuǎn)端大腦前動脈及大腦中動脈的血流。基線條件時，從近端（S3）到遠(yuǎn)端（S1）MCA分支檢測流入速度梯度減少（圖3a-c），但血管直徑保持相對恒定（圖3d）。dMCAO 30min后，C57BL/6小鼠中觀察到強(qiáng)勁的MCA逆流和連接遠(yuǎn)端MCA及ACA的側(cè)支吻合，但Balb/C小鼠中沒有（圖3b）。dMCAO期間，C57BL/6小鼠中大部分臨近ACA和MCA連接點(diǎn)的遠(yuǎn)端MCA小動脈的流速（圖3a）顯著減緩到基線值的56%和31%，Balb/C小鼠更甚，達(dá)到基線值的0.2%和1.7%。此后，C57BL/6小鼠中MCA小動脈更近端的流速和流量逐漸恢復(fù)，dMCAO后7天恢復(fù)了2-3倍（圖3b、c和e）。相反，Balb/C小鼠中，直到dMCAO后7天，S1和S2中的流速、血管直徑和流速沒有顯著恢復(fù)（圖3c-e）。使用DOCT在遠(yuǎn)端MCA小動脈中評估不同品系在LMA血流恢復(fù)上的差異，使用激光多普勒血流儀（LDF）評估MCA區(qū)域rCBF的差異（圖3F），并將二者相關(guān)聯(lián)，表明側(cè)支血流范圍能夠預(yù)測缺血區(qū)的整體血液灌注狀態(tài)。

 

 圖3遠(yuǎn)端MCA閉塞后，C57BL/6小鼠從ACA快速補(bǔ)充逆行側(cè)支血流，而Balb/C小鼠中沒有。（a）大腦背面的軟腦膜血管DOCT圖像。插圖為3個遠(yuǎn)端MCA分支及其相對位置。（b）C57BL/6和Balb/C小鼠DOCT圖像，分別為基線、MCAO期間30 min（dMCAO）、MCAO后24 h、MCAO后7天（7 d）。血液流向掃描探針束或ACA區(qū)域?yàn)榧t色，流向近端MCA的逆向血流為綠色。白色箭頭表示MCA分支，這些分支接受來自ACA的逆行血流。（c）C57BL/6和Balb/C小鼠3個遠(yuǎn)端MCA段的血流速度柱狀圖；（d）血管直徑柱狀圖；（e）流量柱狀圖。

  02-Balb/C小鼠中，卒中引起的大腦中動脈區(qū)網(wǎng)狀小動脈進(jìn)一步加劇

 使用DOCT確定逆行性軟腦膜側(cè)支血流如何影響下游網(wǎng)狀小動脈（PA）中的血流，獲得的en face流速圖譜顯示在圖4a中�？梢奙CAO后30min，C57BL/6和BALB/C小鼠中MCA區(qū)域的總PA流量顯著減少到約基線的13.7%和0.03%（圖4a，b），與之前研究結(jié)論一致，即PA是大腦皮層循環(huán)的瓶頸。C57BL/6小鼠MCA區(qū)域的PA在dMCAO后7天內(nèi)逐漸恢復(fù)到基線流量的49.3%，而同期間內(nèi)Balb/C小鼠僅恢復(fù)到6.7%（圖4b）。品系間總流量的差異體現(xiàn)在dMCAO期間PA的平均截面直徑上（圖4c）。兩個品系在dMCAO期間的ACA區(qū)域檢測到總血流減少，隨后7天恢復(fù)，C57BL/6和Balb/C分別恢復(fù)到基線的72 %和64%（圖4e）。dMCAO期間及后7天，C57BL/6小鼠中MCA區(qū)域PA的最大流速顯著大于Balb/C小鼠（圖4d），而dMCAO期間ACA區(qū)域該趨勢相反（圖4g）。  圖4 卒中后Balb/C小鼠大腦中動脈區(qū)PA血流幾乎耗盡，也幾乎沒有恢復(fù)。（a）在C57BL/6和Balb/C小鼠皮質(zhì)表面下300 μm厚的組織板內(nèi)，OMAG數(shù)據(jù)（上）和雙向DOMAG數(shù)據(jù)（下）。（b-d）每個品系MCA中總流量、平均截面面積和最大軸向流速的動態(tài)變化。（e–g）ACA中的動態(tài)變化。

  03-與C57BL/6小鼠相比，Balb/C小鼠在卒中后的毛細(xì)血管轉(zhuǎn)運(yùn)時間上表現(xiàn)出更大的異質(zhì)性

 評估并比較了不同品系間dMCAO后毛細(xì)血管轉(zhuǎn)運(yùn)時間的平均及空間分布。掩蔽直徑大于15 μm的血管后，OCTA測速獲得的毛細(xì)血管的平均頻率（MF）圖顯示出來（圖5a）。從這些MF信號中推導(dǎo)出MCA和ACA區(qū)轉(zhuǎn)運(yùn)時間的空間分布特征，包括平均毛細(xì)血管轉(zhuǎn)移時間（CTT）和毛細(xì)血管轉(zhuǎn)運(yùn)時間異質(zhì)性（CTTH）（圖2c）。Balb/C小鼠dMCAO后30 min平均CTT增加，并在MAC區(qū)域CCAO逆轉(zhuǎn)后持續(xù)了1h，但在ACA區(qū)域dMCAO期間及后1天都保持增加（圖5b，d），品系間無顯著差異。Balb/C小鼠中，卒中誘導(dǎo)的CTTH增加持續(xù)存在，而且MCA區(qū)域的增加在dMCAO期間較C57BL/6更顯著（圖5c，e），導(dǎo)致微血管阻力增加，卒中后氧攝取減少。Balb/C小鼠ACA區(qū)域的CTTH在dMCAO后也增加，但隨后7天內(nèi)恢復(fù)。不同品系在ACA區(qū)域的CTTH上無顯著差異（圖5e）。  圖5 卒中后，Balb/C小鼠毛細(xì)血管轉(zhuǎn)運(yùn)時間表現(xiàn)出更強(qiáng)的空間異質(zhì)性。（a）皮質(zhì)板中毛細(xì)血管平局頻率圖。Balb/C小鼠卒中后，CTT顯著增加并持續(xù)到CCAO逆流以后，在（b）MCA和（d）ACA區(qū)域都是如此。卒中后CTTH增加，并在（c）MCA區(qū)域持續(xù)高著，或在（d）ACA區(qū)域中持續(xù)到dMCAO后1天。dMCAO期間Balb/C小鼠中CTTH增加較C57BL/6顯著更多。

  04-C57BL/6和Balb/C小鼠在腦血管上的遺傳變異
 為了確定缺血性卒中后固有LMA側(cè)支的范圍是否能幫助逆行血流補(bǔ)償，分析了DiI標(biāo)記的動脈造影圖�；�線時，C57BL/6小鼠ACA和MCA之間表現(xiàn)出明顯更多的相互連接的LMA吻合側(cè)支（圖6a，b），與以前的研究結(jié)果一致。相比之下，Balb/C小鼠的PcomA暢通性更好（圖6c）。兩品系中，ACA和MCA間從中線到邊界的距離在三個水平軸上都基本一致（圖6d），表明二者背側(cè)大腦半球中MCA相關(guān)區(qū)域類似，與以前的發(fā)現(xiàn)結(jié)果一致。
    圖6 C57BL6和Balb/C小鼠MCAO之前固有柔腦膜側(cè)支的范圍對中結(jié)果的預(yù)測。（a）C57BL/6和Balb/C小鼠動脈造影圖。放大的黃色小圖顯示C57BL6小鼠MCA和ACA血管網(wǎng)之間有許多吻合點(diǎn)，但Balb/C小鼠沒有。（b）基線時MCA和ACA間連接側(cè)枝的量化。（c）對兩品系的PcomA暢通性進(jìn)行評分和比較。（d）在三個不同的神經(jīng)軸上測定ACA與MCA間中線到吻合線的距離。（e）與C57BL/6小鼠相比，Balb/C小鼠在卒中后7天的卒中尺寸明顯更大。（f）與卒中后7天的C57BL/6小鼠相比，Balb/C小鼠在（f）高架水平梯測試時滑落更頻繁，并且在（g）轉(zhuǎn)角測試中同側(cè)轉(zhuǎn)彎出現(xiàn)也顯著更多，反映了Balb/C小鼠在感覺運(yùn)動不對稱方面更明顯的功能損傷。

  05-柔腦膜血流的快速招募使梗塞體積和神經(jīng)損傷較小

 dMCAO后7天用云梯和轉(zhuǎn)角測試評估，發(fā)現(xiàn)與Balb/C小鼠相比，在C57BL/6小鼠中LMA血流的快速招募預(yù)示著較好的卒中結(jié)果，梗塞尺寸減�。▓D6e-g）。雖然Balb/C小鼠的血流量和rCBF有所改善，但后期的血流招募并不能挽救已經(jīng)缺血的腦組織，也不能改善卒中后的功能性結(jié)果。

  結(jié)論

 本研究通過比較兩種具有不同側(cè)支程度的小鼠，證明了固有LMA側(cè)支化對快速的側(cè)支血流動力學(xué)性有很大的影響。但由于急性缺血性卒中患者的側(cè)支狀態(tài)取決于側(cè)支血管的重塑，目前的研究可能無法確定人體內(nèi)固有側(cè)支形成是否能單獨(dú)預(yù)測卒中結(jié)果。但有證據(jù)表明LMA的發(fā)展程度是動態(tài)的，運(yùn)動和治療都能起到一定的促進(jìn)作用。先前的研究結(jié)果也證明強(qiáng)調(diào)了LMA側(cè)支重構(gòu)在決定卒中預(yù)后中的關(guān)鍵作用。最后，雖然側(cè)支循環(huán)的程度或狀態(tài)與缺血性損傷之間存在無可爭議的關(guān)系，但缺血性損傷的生物反應(yīng)比較復(fù)雜，單獨(dú)的血管生成可能在治療或預(yù)治療缺血性卒中作用甚微，仍需要進(jìn)一步研究探索。
 

 

參考文獻(xiàn)：Kanoke, Atsushi , et al. "The impact of native leptomeningeal collateralization on rapid blood flow recruitment following ischemic stroke." Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism (2020):0271678X2094126.