注    意：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：
游離脂肪酸，也稱為非酯化脂肪酸，在與白蛋白結(jié)合的血漿中循環(huán)。動物血液中的游離脂肪酸 (FFA )含量是一項重要的生理生化指標(biāo)。血清中游離脂肪酸的濃度與脂類代謝、糖代謝、內(nèi)分泌功能有關(guān)，游離脂肪酸的濃度會因為糖尿病、重癥肝障礙、甲狀腺功能亢進(jìn)等疾病而上升。
 
測定原理：
用有機(jī)溶劑萃取FFA。含有FFA的有機(jī)液與三乙醇胺銅反應(yīng),在有機(jī)相中形成脂肪酸銅 (銅皂) FFA一Cu。Cu離子與顯色液反應(yīng)形成紫紅色絡(luò)合物。反應(yīng)形成的顏色深淺與Cu離子濃度的關(guān)系符合朗伯一比爾定律，因此可利用此反應(yīng)進(jìn)行比色。
 
自備的儀器和用品：
可見分光光度計、離心機(jī)、可調(diào)式移液器、玻璃比色皿、蒸餾水。
 
試劑的組成和配制：
萃取液：液體 60 mL×1瓶，4℃保存；
試劑一：液體 8 mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：液體 8 mL×1瓶，4℃保存；
試劑三：粉劑×1瓶，室溫保存；
試劑四：液體18 mL×1瓶，4℃保存；
 
樣本前處理：
1.動物組織：按照動物組織質(zhì)量（g）：萃取液mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL萃取液），進(jìn)行冰浴勻漿。震蕩提取15min，5000 rpm 4℃離心5min，取有機(jī)相待測。
2.血清：吸取50 μL血清樣本，加入1 mL萃取液，震蕩提取15 min后，4℃，5000 rpm離心5 min，取有機(jī)相待測。
3.微生物、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：萃取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1 mL萃取液）加入萃取液，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲2秒，間隔3秒，總時間3min）；震蕩提取15 min，然后5000 rpm 4℃離心5min，取有機(jī)相待測。
注意：有機(jī)相待測液可能存在于上層，也可能存在于下層，注意觀察，體積較多的那一層即為有機(jī)相待測液。
 
測定步驟：
1、分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至550 nm。
2、工作液的配制：臨用前根據(jù)用量按照試劑一（V）：試劑二（V）：試劑三（m）=1（mL）1（mL）：0.66（g）的比例充分混勻。（注意：現(xiàn)用現(xiàn)配，用多少配多少，在空瓶中配制，試劑盒中帶有4個空瓶，先將試劑一與試劑二混合，最后再加入試劑三粉劑）
3、測定管：吸取750μL樣本，加入250μL工作液，蓋緊后震蕩20 min，4℃，5000 rpm離心5 min，分層后取600μL上層有機(jī)相，加入300μL試劑四，搖勻，10 min后于玻璃比色皿中測定550 nm的吸光值，記為A測定。
4、空白管：吸取750μL萃取液，加入250μL工作液，蓋緊后震蕩20 min，4℃，5000 rpm離心5 min，分層后取600μL上層有機(jī)相，加入300μL試劑四，搖勻，10 min后于玻璃比色皿中測定550 nm的吸光值，記為A測定�？瞻坠苤恍铚y一次。
空白管只需測一次。△A=A測定-A空白
注意：
1、有機(jī)溶劑易揮發(fā)，加入比色皿后應(yīng)盡快檢測。
2、測定管中加入的樣本即樣本前處理中的有機(jī)相待測液。
 
FFA含量計算：
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0322x - 0.0141     R² = 0.9985   x：棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL）y：吸光值差值△A
1、血清FFA含量計算：
FFA含量(μmol/mL)=(△A+0.0141)÷0.0322×V1÷(V3×V1÷V2)÷1000=0.621×(△A+0.0141)
2、動物組織、微生物、細(xì)胞中FFA含量計算：
（1）按樣本質(zhì)量計算
FFA含量(μmol/g鮮重)=(△A+0.0141)÷0.0322×V1÷（W× V1÷V2）÷1000=0.031×(△A+0.0141)÷W
（2）按樣本蛋白濃度計算
FFA含量(μmo/mg prot)= (△A+0.0141)÷0.0322×V1÷(V1×Cpr)÷1000=0.031×(△A+0.0141)÷Cpr
 
V1：加入樣本體積，0.75 mL；V2：萃取液體積，1mL；V3：加入血清（漿）體積，0.05 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：動物組織樣品質(zhì)量，g； 1000：1 μmol=1000 nmol 。
 
注意事項：
蛋白含量不可直接用萃取液提取的有機(jī)相待測液直接測定，可用蒸餾水或緩沖液或生理鹽水選用本公司的BCA法蛋白含量測定試劑盒。
最低檢出限為10 nmol/mL。