背景
 

HEK-293人胚腎細(xì)胞：是用5型腺病毒75株系轉(zhuǎn)化，含有Ad5 E1區(qū)的人胚腎亞三倍體細(xì)胞系，是一種E1區(qū)缺陷互補(bǔ)細(xì)胞系。它是加拿大McMaster University的F.L.Graham與J.S.Miley于1976年用DNA轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建而成。該細(xì)胞為人類腺病毒載體擴(kuò)增的宿主。可表達(dá)異常的玻連蛋白的細(xì)胞表面受體，由整合素β1亞單位和玻連蛋白受體α-v亞單位組成。

 

HEK-293T人胚腎細(xì)胞：人胚腎細(xì)胞293細(xì)胞插入SV40 T-抗原基因后產(chǎn)生的高轉(zhuǎn)染效率的衍生株稱為293T。該細(xì)胞最初的名字是293tsA1609neo，攜帶SV40復(fù)制序列，被廣泛用于逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)、基因表達(dá)和蛋白表達(dá)。

 

HEK-293FT人胚腎細(xì)胞：該細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)SV40大T抗原，并且促進(jìn)最適病毒產(chǎn)物的產(chǎn)生。293FT細(xì)胞能制造高滴度的慢病毒。

 

293A人胚腎細(xì)胞:細(xì)胞來源于人腎纖維母細(xì)胞，組成性表達(dá) E1A 和 E1B 蛋白。

 

從背景知識我們應(yīng)該知道怎么選擇所需求的細(xì)胞了吧!

 

                                                                            形態(tài)
 

          293T 

 

                                                                  人胚腎細(xì)胞

      人胚腎細(xì)胞是貼壁依賴型呈上皮樣細(xì)胞，表現(xiàn)出典型的腺病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞的表型，哺乳細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)方式有三種：貼壁培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、無血清懸浮培養(yǎng)。這三種方式均可用于人胚腎細(xì)胞細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。

 

                                                                人胚腎細(xì)胞培養(yǎng)特性

  

大家都知道人胚腎細(xì)胞在運(yùn)輸、高密度、偏堿性環(huán)境、低溫等情況下很容易漂浮脫落。如果您是購買的復(fù)蘇好的培養(yǎng)瓶，收到貨時可能會是這樣的：

 

 

 

1遇到這樣該怎么處理?

1、建議收到細(xì)胞后放培養(yǎng)箱靜止2h-4h后觀察細(xì)胞是否再次恢復(fù)貼壁;

2、如果貼壁可去除培養(yǎng)基輕柔pbs洗一次后，加入Trypsin作用30s-60s鏡下觀察細(xì)胞變圓,就可加DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，吹打4-6次至細(xì)胞全成單個懸浮細(xì)胞即可。12小時-24小時90%以上細(xì)胞會貼壁；

3、如果細(xì)胞沒有恢復(fù)貼壁，可以收集培養(yǎng)瓶內(nèi)液體離心1000轉(zhuǎn)5min收集細(xì)胞，接種到新培養(yǎng)瓶，添加新鮮的完全培養(yǎng)基，T25培養(yǎng)瓶建議加7ml完全培養(yǎng)基;

4、必要時加使用多聚賴氨酸、纖連蛋白進(jìn)行包被，促進(jìn)細(xì)胞的延展和貼壁;

 

2培養(yǎng)過程中的小細(xì)節(jié)： 

1. 人胚腎細(xì)胞生長快速，當(dāng)細(xì)胞傳代時機(jī)為達(dá)80-90%匯合，傳代比例建議為1：3；

2. 一般來講，1:10傳代后，一周可以長滿。嚴(yán)禁高密度過度生長。不然會導(dǎo)致細(xì)胞密度加大和堆積消化后不分散;

3. 人胚腎細(xì)胞生長貼壁不牢固，觀察時間長后容易飄浮，建議觀察后立即進(jìn)行處理或放入培養(yǎng)箱，換液時建議預(yù)熱完全培養(yǎng)基；

4. 人胚腎細(xì)胞在低代數(shù)時容易貼壁，生長良好，在傳到幾十代以后，易聚集成團(tuán)，且貼壁不牢，用PBS沖洗時即可能脫落，即使消化后也不容易吹打成單細(xì)胞懸液，最好購入時先大量凍存;

5. 人胚腎細(xì)胞生長明顯適應(yīng)酸性環(huán)境,pH值在6.9～7.1時,可順利貼壁生長, 換液時動作要輕。一般用高糖的DMEM培養(yǎng)基；

6. 人胚腎細(xì)胞復(fù)蘇時貼壁很慢，復(fù)蘇接種后24小時內(nèi),應(yīng)盡量減少觀察細(xì)胞次數(shù)或不作觀察,以免因晃動而影響細(xì)胞貼壁。復(fù)蘇后48小時左右觀察貼壁情況并進(jìn)行首次更換培養(yǎng)基比較合適,如果用一次性塑料培養(yǎng)瓶可增加細(xì)胞貼壁牢度。換液前宜將培養(yǎng)基預(yù)熱;

 

3轉(zhuǎn)染小攻略

 

1、建議使用10代內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行包轉(zhuǎn)染；

2、體外應(yīng)用293細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染時，如果是采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染、慢病毒包毒液時，一定要注意293細(xì)胞不要全部長滿細(xì)胞培養(yǎng)盤，高密度細(xì)胞加入磷酸鈣就會使293細(xì)胞大片的脫落，最好是當(dāng)293生長到1/2或2/3時進(jìn)行磷酸鈣轉(zhuǎn)染，可以避免細(xì)胞的大量脫落；

3、慢病毒感染后可收取兩次病毒液，48H建議用正常血清濃度培養(yǎng)收毒，72h時建議使用低濃度血清進(jìn)行培養(yǎng)，這樣收的毒液滴度大大增加；

4、必要時候用大瓶培養(yǎng)比小瓶要好，這樣有利于293均勻的分布，利于營養(yǎng)的攝取，病毒顆粒的釋放；

我司提供慢病毒構(gòu)建的穩(wěn)轉(zhuǎn)株服務(wù)使用的是293FT細(xì)胞，該細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高、慢病毒滴度高，有效運(yùn)用于細(xì)胞系的紅色、綠色、LUC等細(xì)胞系的標(biāo)記。

 

      PC-3-GFP標(biāo)記