椎間盤退行性變（IVD）是導致腰痛（LBP）的主要原因，已成為影響人類生活的全球性社會問題。目前，椎間盤退變的治療方法有保守治療和和脊柱手術減壓，旨在減輕疼痛，讓患者恢復工作。然而，這兩種策略都不能有效治療 IVD 變性。

目前，干細胞療法成為修復 IVD 退行性病變的新治療策略。間充質干細胞（MSCs）可以分化為髓核（NP）樣細胞并促進細胞外基質（ECM）的合成，在治療 IVD 變性方面表現(xiàn)出巨大的潛力。近年來發(fā)現(xiàn)，MSCs 存在于 NP 組織中，這些髓核間充質干細胞（NP-MSCs）有效地修復了 NP 組織。許多研究表明，IVD-MSCs 數(shù)量和功能的喪失與 IVD 退行性密切相關。

機械應力是 IVD 退變的重要誘因。一般來說，IVD 在日常生活中經(jīng)歷各種機械壓力。有研究報道，過度壓力導致椎間盤退變與椎間盤細胞的活性和凋亡的發(fā)生密切相關，壓力會通過誘導髓核細胞凋亡導致椎間盤退變。近年來，有研究顯示壓力不僅會導致髓核干細胞凋亡，還能影響髓核干細胞的生物學行為。因此，在椎間盤內(nèi)壓力等不利微環(huán)境下，如何減少髓核干細胞的死亡，將成為椎間盤退變的一種重要的治療策略。

吡格列酮被認為是過氧化物酶體增殖物激活受體γ激活劑，用于治療糖尿病，其可以調節(jié)炎癥反應、細胞內(nèi)脂質代謝、能量平衡等。研究報道，吡格列酮通過抗氧化應激保護胰腺細胞免受棕櫚酸誘導的細胞毒性，還能通過改變 Bcl-2 表達和 caspase-3 活化來減輕由 TNF -α 誘導的細胞凋亡或細胞應激水平。此外，吡格列酮能緩解糖基化晚期終末產(chǎn)物誘導的軟骨細胞凋亡，治療骨關節(jié)炎。然而，吡格列酮對壓縮誘導的 NP-MSCs 死亡的影響仍然未知。

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科、心內(nèi)科，附屬同濟醫(yī)院血液內(nèi)科的一項研究中，采用不同的方法來評估吡格列酮對壓力誘導的 NP-MSCs 凋亡的保護作用，通過檢測氧化應激水平和線粒體功能以及線粒體凋亡相關蛋白，評估線粒體途徑在吡格列酮保護壓力誘導的 NP-MSCs 凋亡中的作用。

為了研究吡格列酮對壓縮暴露的 NP-MSCs 的影響，細胞用不同濃度的吡格列酮（0 μM、10  μM、20  μM、50  μM和 100  μM）處理并暴露于 1.0 MPa 壓縮力下持續(xù)36 小時，用于隨后實驗。對照組細胞（con）表示無藥物、無壓力。

吡格列酮減輕壓力對細胞活力和細胞增殖的抑制作用
進行 CCK-8 測定以確定 NP-MSCs 的活性。結果表明，吡格列酮對 NP-MSCs 無細胞毒性。實驗發(fā)現(xiàn)，壓縮顯著降低了細胞活性。為了研究吡格列酮對 NP-MSCs 的保護作用，用不同濃度的吡格列酮處理 NP-MSCs，發(fā)現(xiàn)吡格列酮顯著減輕了壓縮對細胞活力的抑制作用，并且在100 μM 的劑量下保護作用明顯。此外，使用 EdU 摻入法檢測細胞增殖。結果表明，吡格列酮組 EdU 陽性細胞數(shù)（紅色熒光）多于加壓組。這證明吡格列酮顯著減輕了壓力對細胞增殖的抑制作用。

吡格列酮可防止 NP-MSCs 中的壓力誘導的細胞毒性

鬼筆環(huán)肽用于檢測 NP-MSCs 的肌動蛋白絲。結果表明，壓力明顯破壞了肌動蛋白應力纖維，吡格列酮挽救了壓力造成的不良后果。隨后，檢測乳酸脫氫酶（LDH）的釋放。結果表明，與對照組相比，壓力顯著促進了 LDH 的釋放。吡格列酮顯著逆轉壓縮力誘導的 LDH 釋放。

為了進一步評估吡格列酮對壓縮誘導的 NP-MSCs 細胞毒性的保護作用，使用Calcein-AM / PI 染色在熒光顯微鏡下量化活/死細胞的數(shù)量。結果發(fā)現(xiàn)，吡格列酮組中的活細胞（綠色熒光）較多，而加壓組中的死細胞（紅色熒光）較多。這表明，吡格列酮可保護 NP-MSCs 免受壓力誘導的細胞毒性。

 

吡格列酮對壓力誘導的 NP-MSCs 凋亡的保護作用

為了探索吡格列酮對壓力誘導的細胞凋亡的保護作用，使用 Annexin V-FITC/PI 雙染色來檢測 NP-MSCs 的細胞凋亡。結果顯示，壓力誘導了 NP-MSCs 凋亡。吡格列酮可顯著保護壓力誘導的 NP-MSCs 凋亡。

為了進一步檢查吡格列酮的保護作用，使用 TUNEL 染色在熒光顯微鏡下研究細胞凋亡的變化。TUNEL 染色顯示，吡格列酮組 TUNEL 陽性細胞較壓力組明顯減少。這表明，吡格列酮對壓力誘導的 NP-MSCs 凋亡具有保護作用。

 

吡格列酮降低 NP-MSCs 中的壓力誘導的氧化應激

氧化應激水平的升高導致線粒體功能障礙并導致細胞凋亡。為了研究吡格列酮對 NP-MSCs 氧化應激的影響，實驗使用 DCFH-DA 熒光探針檢測 ROS 的產(chǎn)生來評估 NP-MSCs 的氧化應激水平。結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，壓力顯著增加了細胞內(nèi) ROS 的產(chǎn)生。吡格列酮可顯著降低壓力誘導的 ROS 產(chǎn)生。

此外，還通過 MDA 檢測試劑盒評估了氧化應激水平。數(shù)據(jù)顯示，吡格列酮顯著降低了壓力誘導的髓核干細胞內(nèi) MDA 的較高表達。這表明，吡格列酮減輕了 NP-MSCs 中壓力誘導的氧化應激水平。

 

吡格列酮減輕 NP-MSCs 中壓力誘導的線粒體損傷

線粒體損傷是線粒體凋亡途徑中的一個重要因素。當發(fā)生線粒體膜電位（MMP）損傷時，JC-1 從 JC-1 聚合物（紅色熒光）轉變?yōu)?JC-1 單體（綠色熒光）。為了評估吡格列酮對 NP-MSCs 中壓力誘導的線粒體損傷的保護作用，實驗進行 JC-1 染色，流式細胞術分析檢測 NP-MSCs 中的 MMP。

結果發(fā)現(xiàn)，與壓力組相比，壓力降低了 NP-MSCs 中的紅/綠比，吡格列酮顯著增加了紅/綠比。另外用熒光顯微鏡觀察吡格列酮的保護作用。在加壓組中，NP-MSCs 的紅色熒光較少，綠色熒光較多，而吡格列酮可以增加紅色熒光，減少綠色熒光。

同時應用透射電鏡 TEM 直觀地觀察 NP-MSCs 的超微結構。當 NP-MSCs 受壓時，細胞核皺縮，出現(xiàn)凋亡小體，線粒體數(shù)量明顯減少，大量的脂滴形成。幸運的是，吡格列酮可以顯著減輕 NP-MSCs 超微結構的損傷。與壓力組相比，吡格列酮組中細胞核相對完整，線粒體數(shù)量和形態(tài)均有所改善。

 

吡格列酮對加壓下 NP-MSCs 線粒體凋亡相關蛋白表達的影響
為了研究吡格列酮對壓力誘導的線粒體凋亡途徑相關蛋白表達變化的影響，實驗使用蛋白質印跡法檢測凋亡相關蛋白的表達。結果顯示，與吡格列酮組相比，加壓組抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表達降低，而促凋亡蛋白 Bax 的表達增加。此外發(fā)現(xiàn)，壓力能促進 cytochrome c 的表達，并進一步活化 caspase-9，從而激活 caspase-3，導致細胞凋亡。然而，吡格列酮顯著逆轉了這些影響。此外對蛋白質水平進行了定量分析。

該研究的結果表明，吡格列酮通過抑制氧化應激和線粒體損傷來減輕壓力誘導的 NP-MSC 凋亡。吡格列酮對壓力誘導的細胞凋亡的潛在分子保護機制涉及線粒體途徑�？傊�，這些發(fā)現(xiàn)將進一步豐富椎間盤退變的治療方法，為椎間盤退變的治療提供理論基礎。

參考文獻：Hu Y, Huang L, Shen M, Liu Y, Liu G, Wu Y, Ding F, Ma K, Wang W, Zhang Y, Shao Z, Cai X, Xiong L. Pioglitazone Protects Compression-Mediated Apoptosis in Nucleus Pulposus Mesenchymal Stem Cells by Suppressing Oxidative Stress. Oxid Med Cell Longev. 2019 Nov 22;2019:4764071. doi: 10.1155/2019/4764071. PMID: 31885796; PMCID: PMC6893265.


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