Nano Letters：DNA長(zhǎng)度決定著細(xì)胞內(nèi)SWCNTs的“命運(yùn)
單壁碳納米管（SWCNTs）因在近紅外（NIR）區(qū)域有穩(wěn)定的光致發(fā)光特性而在生物成像領(lǐng)域應(yīng)用頗多。單鏈DNA可以通過(guò)非共價(jià)鍵與SWCNTs結(jié)合（DNA-SWCNTs），使SWCNTs有更好的生物相容性。研究表明，SWCNTs進(jìn)入人體之后，會(huì)被巨噬細(xì)胞“內(nèi)化”，并在溶酶體定位。對(duì)SWCNTs的表面進(jìn)行修飾，可以改變SWCNTs在細(xì)胞內(nèi)的“命運(yùn)”。但是，人們對(duì)DNA單鏈的長(zhǎng)度如何影響DNA-SWCNTs在復(fù)雜細(xì)胞環(huán)境中的代謝知之甚少。
2019年3月，美國(guó)羅德島大學(xué)Daniel Roxbury教授課題組在《Nano Letters》發(fā)表題為“Biomolecular Functionalization of a Nanomaterial To Control Stability and Retention within Live Cells”的文章，介紹了DNA-SWCNTs與細(xì)胞之間相互作用的關(guān)系。
DNA單鏈的長(zhǎng)度與DNA-SWCNTs熒光強(qiáng)度的關(guān)系
為了研究DNA單鏈的長(zhǎng)度對(duì)DNA-SWCNTs光學(xué)特性的影響，作者先用五種單鏈DNA（(GT)n，n=6，9，12，15，30）對(duì)SWCNTs進(jìn)行修飾，后與小鼠巨噬細(xì)胞一起培養(yǎng)30分鐘（(GT)n-SWCNTs濃度：1mg/L）。當(dāng)用730 nm激光激發(fā)時(shí)，大多數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)出明亮的寬頻發(fā)射（900-1600nm），說(shuō)明DNA-CNTs被細(xì)胞“內(nèi)化”。作者探究了熒光強(qiáng)度與DNA單鏈的長(zhǎng)度和時(shí)間的關(guān)系，結(jié)果顯示，DNA-SWCNTs熒光強(qiáng)度與DNA單鏈長(zhǎng)度成正比而與時(shí)間成反比。有趣的是，具有較長(zhǎng)DNA單鏈的DNA-SWCNTs的初始的熒光強(qiáng)度分布較廣，說(shuō)明長(zhǎng)鏈DNA使DNA-SWCNTs對(duì)近紅外光更敏感。作者對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA-SWCNTs的熒光強(qiáng)度進(jìn)行了量化并計(jì)算了細(xì)胞內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度隨著DNA鏈長(zhǎng)的增加而增加，皮爾森相關(guān)系數(shù)分別為0.846、0.885和0.850，證實(shí)兩者線性相關(guān)且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）
圖1：DNA-SWCNTs的熒光強(qiáng)度與DNA單鏈長(zhǎng)度的關(guān)系；（a）(GT)15-SWCNTs的熒光圖像、白光圖像和整合的熒光/白光圖像；（b）DNA-SWCNTs的熒光圖像；（c）DNA-SWCNTs熒光強(qiáng)度柱形圖；（d）DNA-SWCNTs的平均熒光強(qiáng)度
DNA-SWCNTs熒光強(qiáng)度與DNA單鏈長(zhǎng)度和SWCNTs手性的關(guān)系
為了進(jìn)一步比較SWCNTs手性與熒光穩(wěn)定性的關(guān)系，作者將發(fā)射中心波長(zhǎng)轉(zhuǎn)化為能量，并將DNA-CNTs的熒光強(qiáng)度與對(duì)照組做了對(duì)比。研究表明，5種DNA-SWCNTs中，只有(GT)6-SWCNTs熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，其他4種DNA-SWCNTs的熒光強(qiáng)度有適度的損失。對(duì)于某一種手性的SWCNTs而言，(GT)n-SWCNTs熒光強(qiáng)度損失沒(méi)有在同一時(shí)間段內(nèi)發(fā)生，說(shuō)明熒光強(qiáng)度的損失是多種因素的結(jié)果。為了在單細(xì)胞水平上研究光譜位移，作者利用高光譜技術(shù)繪制了(GT)6-SWCNTs和(GT)30-SWCNTs的高光譜圖像，并將高光譜圖像中每一個(gè)包含SWCNTs像素點(diǎn)擬合到洛倫茲曲線上，用(94)-SWCNTs的中心輻射能量圖覆蓋白光圖，并為每個(gè)圖像構(gòu)建直方圖以描述細(xì)胞內(nèi)SWCNTs發(fā)射能量的變化。作者發(fā)現(xiàn)，0h的時(shí)候，(GT)6-SWCNTs和(GT)30-SWCNTs的熒光強(qiáng)度在統(tǒng)計(jì)意義上完全相同。將直方圖進(jìn)行高斯擬合，可以通過(guò)半全寬來(lái)評(píng)估總體的異質(zhì)性。研究表明，內(nèi)化后(GT)6-SWCNTs的半高寬是(GT)30-SWCNTs的兩倍，且(GT)30-SWCNTs的輻射強(qiáng)度不隨時(shí)間變化。6 h后，(GT)6-SWCNTs的發(fā)射能量降低了8 meV，半高寬降低了50%。作者認(rèn)為，這種近紅外光熒光強(qiáng)度的變化是DNA-SWCNTs復(fù)合物的DNA單鏈末端相對(duì)豐度變化的結(jié)果，對(duì)于DNA-SWCNTs中一定質(zhì)量的DNA，(GT)6-SWCNTs中DNA單鏈數(shù)是(GT)30-SWCNTs的5倍（圖2）。
圖2：熒光強(qiáng)度與DNA單鏈的長(zhǎng)度和SWCNTs手性的關(guān)系；（a）細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的熱圖；（b）(GT)6-SWCNTs和（c）(GT)30-SWCNTs的白光圖和高光譜圖像的疊加圖和熒光能量分布直方圖
細(xì)胞內(nèi)DNA-SWCNTs熒光強(qiáng)度的穩(wěn)定性
被細(xì)胞內(nèi)化的DNA-SWCNTs的光譜穩(wěn)定性有較大差異。作者基于SWCNTs對(duì)常規(guī)有機(jī)熒光團(tuán)的淬滅效應(yīng)，設(shè)計(jì)了一種檢驗(yàn)DNA-CNTs完整性的方法。實(shí)驗(yàn)人員首先用Cy3對(duì)(GT)6-SWCNTs和(GT)30-SWCNTs進(jìn)行標(biāo)記，脫氧膽酸鈉（SDC）小分子通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制取代Cy3-DNA附著在SWCNTs的表面，使原來(lái)發(fā)生熒光淬滅效應(yīng)的SWCNTs重新發(fā)出明亮的熒光。盡管SDC的置換動(dòng)力學(xué)不相同，但Cy3-(GT)6-SWCNTs和Cy3-(GT)30-SWCNTs的熒光淬滅動(dòng)力學(xué)是相似的。當(dāng)用含有Cy3-(GT)6-SWCNTs和Cy3-(GT)30-SWCNTs的細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)巨噬細(xì)胞時(shí)，Cy3-(GT)6-SWCNTs和Cy3-(GT)30-SWCNTs的熒光淬滅現(xiàn)象有很大的不同，Cy3-(GT)6-SWCNTs很快的發(fā)生熒光淬滅并在4 h達(dá)到最大熒光強(qiáng)度，24h后降至初始熒光強(qiáng)度；相比之下，Cy3-(GT)6-SWCNTs則在任何時(shí)間段均未觀察到熒光淬滅現(xiàn)象（圖3）。
圖3：DNA-SWCNTs在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性；（a）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖：SWCTNs被DNA單鏈緊密包裹時(shí)，未發(fā)生熒光淬滅現(xiàn)象，DNA單鏈解離時(shí)發(fā)出強(qiáng)烈熒光；（b）熒光強(qiáng)度隨SDC小分子置換時(shí)間的增加而增加；（c）用Cy3-(GT)6-SWCNTs和Cy3-(GT)30-SWCNTs培養(yǎng)的RAW 264.7細(xì)胞的白光圖和熒光圖的疊加；（d）平均熒光強(qiáng)度直方圖
細(xì)胞對(duì)DNA-SWCNTs的“內(nèi)化”和“外排”
盡管SWCNTs的熒光強(qiáng)度受到濃度和局部環(huán)境的影響，但是SWCNTs的某些特征只和濃度有關(guān)，這就意味著，無(wú)論樣本的熒光強(qiáng)度如何，SWCNTs的手性信息在拉曼圖譜中都可以被表達(dá)出來(lái)。作者使用共聚焦拉曼顯微鏡評(píng)估了SWCNTs在細(xì)胞內(nèi)的局部濃度，首先使用1mg/L的Cy3-(GT)6-SWCNTs或Cy3-(GT)30-SWCNTs培養(yǎng)巨噬細(xì)胞30分鐘，對(duì)0.5μm的微小區(qū)域進(jìn)行拉曼成像。為了計(jì)算出每個(gè)細(xì)胞內(nèi)SWCNTs的質(zhì)量，作者得出了G峰與SWCNTs濃度的特征曲線。Cy3-(GT)6-SWCNTs培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中SWCNTs的起始濃度是Cy3-(GT)30-SWCNTs培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞的兩倍；24 h后，Cy3-(GT)6-SWCNTs培育的巨噬細(xì)胞內(nèi)SWCNTs的濃度下降了75%，而Cy3-(GT)30-SWCNTs培育的巨噬細(xì)胞內(nèi)SWCNTs的濃度下降較小。作者將Cy3-(GT)6-SWCNTs培育的巨噬細(xì)胞內(nèi)SWCNTs的起始濃度高的原因歸結(jié)于單根SWCNTs上的DNA密度較大，這增加了細(xì)胞膜蛋白與DNA相互接觸的概率；相反，也正是由于膜蛋白與DNA接觸概率的增大，從而使得巨噬細(xì)胞可以更快的以胞吐的形式“釋放”SWCNTs。
為了更好的理解胞吐機(jī)制，作者對(duì)細(xì)胞“釋放”(GT)6-SWCNTs的途徑進(jìn)行了探究。作者設(shè)計(jì)了一個(gè)實(shí)驗(yàn)，用巴弗洛霉素A1和諾考達(dá)唑（兩種抑制細(xì)胞溶酶體胞吐作用的化學(xué)藥物）對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行了處理，并比較細(xì)胞內(nèi)DNA-SWCNTs的濃度。結(jié)果顯示，(GT)6-SWCNTs在細(xì)胞內(nèi)的濃度高于對(duì)照組，(GT)30-SWCNTs的濃度與對(duì)照組相比變化不大；相反，用布雷非德菌素A和Exo1（兩種抑制高爾基體分泌的化學(xué)藥物）對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行處理，結(jié)果顯示，(GT)6-SWCNTs和(GT)30-SWCNTs的濃度與對(duì)照組相比差異性較小；這說(shuō)明細(xì)胞主要是通過(guò)溶酶體的胞吐作用來(lái)實(shí)現(xiàn)DNA-CNTs的“釋放”（圖4和圖5）。
圖4：通過(guò)共聚焦顯微鏡確定SWCNTs的濃度；（a）Cy3-(GT)6-SWCNTs和Cy3-(GT)30-SWCNTs培養(yǎng)的RAW 264.7細(xì)胞的G峰強(qiáng)度圖和白光圖（b）從細(xì)胞中ROI區(qū)域像素點(diǎn)計(jì)算得出的SWCNTs的濃度；（c）被細(xì)胞內(nèi)化的SWCNTs的比值；（d）細(xì)胞上清液中外源性SWCNTs的濃度；（e）共聚焦拉曼光譜G峰強(qiáng)度圖與白光圖的疊加；（f）在（e）圖中包含SWCNTs的所有像素點(diǎn)的平均濃度
溶酶體胞吐的主要功能之一是分泌各種生物大分子，如蛋白質(zhì)、酶和抗原，以進(jìn)行細(xì)胞之間的信息傳遞，也可使周?chē)?xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)。有研究表明，對(duì)SWCNTs的表面進(jìn)行修飾可以有效降低對(duì)細(xì)胞的毒性，原始的SWCNTs與細(xì)胞膜上的受體相互作用之后會(huì)被認(rèn)為是一個(gè)有害物質(zhì)。因此，作者認(rèn)為溶酶體將DNA鏈段從DNA-SWCNTs復(fù)合物上去除后，會(huì)使得細(xì)胞將“裸露”的SWCNTs當(dāng)做異物，而引發(fā)細(xì)胞的胞吐作用將其排出，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)SWCNTs的濃度降低；而長(zhǎng)鏈的DNA對(duì)SWCNTs的包覆比較嚴(yán)密，溶酶體無(wú)法將DNA-SWCNTs復(fù)合物上的DNA“剔除”，從而無(wú)法產(chǎn)生胞吐作用，這會(huì)導(dǎo)致(GT)30-SWCNTs在細(xì)胞內(nèi)的滯留。
圖5：DNA長(zhǎng)度相關(guān)性的細(xì)胞內(nèi)加工示意圖；（a）巨噬細(xì)胞將(GT)6-SWCNTs復(fù)合物內(nèi)化并在溶酶體內(nèi)定位，隨后生物分子與DNA鏈發(fā)生交換，并迅速誘導(dǎo)溶酶體胞吐；（b）巨噬細(xì)胞將(GT)30-SWCNTs復(fù)合物內(nèi)化并在溶酶體內(nèi)定位，而DNA-SWCNTs的完整性使SWCNTs被長(zhǎng)時(shí)間保留在細(xì)胞內(nèi)
結(jié)論
作者借助于可見(jiàn)-近紅外高光譜成像和共聚焦拉曼顯微技術(shù)，發(fā)現(xiàn)DNA單鏈的長(zhǎng)度對(duì)DNA-SWCNTs的光學(xué)穩(wěn)定性有影響，通過(guò)調(diào)節(jié)DNA單鏈的長(zhǎng)度可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞“攝入”和“外排”SWCNTs的調(diào)節(jié)；DNA-CNTs上較短的DNA單鏈在溶酶體內(nèi)被細(xì)胞的生物小分子取代，改變了SWCNTs的物理特性和在細(xì)胞內(nèi)的“命運(yùn)”；最后通過(guò)藥物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了細(xì)胞對(duì)SWCNTs的“外排”是通過(guò)胞吐作用。這些發(fā)現(xiàn)有助于人們進(jìn)一步理解SWCNTs與細(xì)胞之間的相互作用，也為后續(xù)科研人員進(jìn)一步探究細(xì)胞對(duì)官能化小分子的“響應(yīng)性”奠定了理論基礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn)
[1] Gravely M, Safaee M M, Roxbury D.Biomolecular Functionalization of a Nanomaterial To Control Stability andRetention within Live Cells[J]. Nano Letters, 2019, 19(9) 6203-6212.
2019年3月，美國(guó)羅德島大學(xué)Daniel Roxbury教授課題組在《Nano Letters》發(fā)表題為“Biomolecular Functionalization of a Nanomaterial To Control Stability and Retention within Live Cells”的文章，介紹了DNA-SWCNTs與細(xì)胞之間相互作用的關(guān)系。
DNA單鏈的長(zhǎng)度與DNA-SWCNTs熒光強(qiáng)度的關(guān)系
為了研究DNA單鏈的長(zhǎng)度對(duì)DNA-SWCNTs光學(xué)特性的影響，作者先用五種單鏈DNA（(GT)n，n=6，9，12，15，30）對(duì)SWCNTs進(jìn)行修飾，后與小鼠巨噬細(xì)胞一起培養(yǎng)30分鐘（(GT)n-SWCNTs濃度：1mg/L）。當(dāng)用730 nm激光激發(fā)時(shí)，大多數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)出明亮的寬頻發(fā)射（900-1600nm），說(shuō)明DNA-CNTs被細(xì)胞“內(nèi)化”。作者探究了熒光強(qiáng)度與DNA單鏈的長(zhǎng)度和時(shí)間的關(guān)系，結(jié)果顯示，DNA-SWCNTs熒光強(qiáng)度與DNA單鏈長(zhǎng)度成正比而與時(shí)間成反比。有趣的是，具有較長(zhǎng)DNA單鏈的DNA-SWCNTs的初始的熒光強(qiáng)度分布較廣，說(shuō)明長(zhǎng)鏈DNA使DNA-SWCNTs對(duì)近紅外光更敏感。作者對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA-SWCNTs的熒光強(qiáng)度進(jìn)行了量化并計(jì)算了細(xì)胞內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度隨著DNA鏈長(zhǎng)的增加而增加，皮爾森相關(guān)系數(shù)分別為0.846、0.885和0.850，證實(shí)兩者線性相關(guān)且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）
圖1：DNA-SWCNTs的熒光強(qiáng)度與DNA單鏈長(zhǎng)度的關(guān)系；（a）(GT)15-SWCNTs的熒光圖像、白光圖像和整合的熒光/白光圖像；（b）DNA-SWCNTs的熒光圖像；（c）DNA-SWCNTs熒光強(qiáng)度柱形圖；（d）DNA-SWCNTs的平均熒光強(qiáng)度
DNA-SWCNTs熒光強(qiáng)度與DNA單鏈長(zhǎng)度和SWCNTs手性的關(guān)系
為了進(jìn)一步比較SWCNTs手性與熒光穩(wěn)定性的關(guān)系，作者將發(fā)射中心波長(zhǎng)轉(zhuǎn)化為能量，并將DNA-CNTs的熒光強(qiáng)度與對(duì)照組做了對(duì)比。研究表明，5種DNA-SWCNTs中，只有(GT)6-SWCNTs熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，其他4種DNA-SWCNTs的熒光強(qiáng)度有適度的損失。對(duì)于某一種手性的SWCNTs而言，(GT)n-SWCNTs熒光強(qiáng)度損失沒(méi)有在同一時(shí)間段內(nèi)發(fā)生，說(shuō)明熒光強(qiáng)度的損失是多種因素的結(jié)果。為了在單細(xì)胞水平上研究光譜位移，作者利用高光譜技術(shù)繪制了(GT)6-SWCNTs和(GT)30-SWCNTs的高光譜圖像，并將高光譜圖像中每一個(gè)包含SWCNTs像素點(diǎn)擬合到洛倫茲曲線上，用(94)-SWCNTs的中心輻射能量圖覆蓋白光圖，并為每個(gè)圖像構(gòu)建直方圖以描述細(xì)胞內(nèi)SWCNTs發(fā)射能量的變化。作者發(fā)現(xiàn)，0h的時(shí)候，(GT)6-SWCNTs和(GT)30-SWCNTs的熒光強(qiáng)度在統(tǒng)計(jì)意義上完全相同。將直方圖進(jìn)行高斯擬合，可以通過(guò)半全寬來(lái)評(píng)估總體的異質(zhì)性。研究表明，內(nèi)化后(GT)6-SWCNTs的半高寬是(GT)30-SWCNTs的兩倍，且(GT)30-SWCNTs的輻射強(qiáng)度不隨時(shí)間變化。6 h后，(GT)6-SWCNTs的發(fā)射能量降低了8 meV，半高寬降低了50%。作者認(rèn)為，這種近紅外光熒光強(qiáng)度的變化是DNA-SWCNTs復(fù)合物的DNA單鏈末端相對(duì)豐度變化的結(jié)果，對(duì)于DNA-SWCNTs中一定質(zhì)量的DNA，(GT)6-SWCNTs中DNA單鏈數(shù)是(GT)30-SWCNTs的5倍（圖2）。
圖2：熒光強(qiáng)度與DNA單鏈的長(zhǎng)度和SWCNTs手性的關(guān)系；（a）細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的熱圖；（b）(GT)6-SWCNTs和（c）(GT)30-SWCNTs的白光圖和高光譜圖像的疊加圖和熒光能量分布直方圖
細(xì)胞內(nèi)DNA-SWCNTs熒光強(qiáng)度的穩(wěn)定性
被細(xì)胞內(nèi)化的DNA-SWCNTs的光譜穩(wěn)定性有較大差異。作者基于SWCNTs對(duì)常規(guī)有機(jī)熒光團(tuán)的淬滅效應(yīng)，設(shè)計(jì)了一種檢驗(yàn)DNA-CNTs完整性的方法。實(shí)驗(yàn)人員首先用Cy3對(duì)(GT)6-SWCNTs和(GT)30-SWCNTs進(jìn)行標(biāo)記，脫氧膽酸鈉（SDC）小分子通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制取代Cy3-DNA附著在SWCNTs的表面，使原來(lái)發(fā)生熒光淬滅效應(yīng)的SWCNTs重新發(fā)出明亮的熒光。盡管SDC的置換動(dòng)力學(xué)不相同，但Cy3-(GT)6-SWCNTs和Cy3-(GT)30-SWCNTs的熒光淬滅動(dòng)力學(xué)是相似的。當(dāng)用含有Cy3-(GT)6-SWCNTs和Cy3-(GT)30-SWCNTs的細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)巨噬細(xì)胞時(shí)，Cy3-(GT)6-SWCNTs和Cy3-(GT)30-SWCNTs的熒光淬滅現(xiàn)象有很大的不同，Cy3-(GT)6-SWCNTs很快的發(fā)生熒光淬滅并在4 h達(dá)到最大熒光強(qiáng)度，24h后降至初始熒光強(qiáng)度；相比之下，Cy3-(GT)6-SWCNTs則在任何時(shí)間段均未觀察到熒光淬滅現(xiàn)象（圖3）。
圖3：DNA-SWCNTs在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性；（a）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖：SWCTNs被DNA單鏈緊密包裹時(shí)，未發(fā)生熒光淬滅現(xiàn)象，DNA單鏈解離時(shí)發(fā)出強(qiáng)烈熒光；（b）熒光強(qiáng)度隨SDC小分子置換時(shí)間的增加而增加；（c）用Cy3-(GT)6-SWCNTs和Cy3-(GT)30-SWCNTs培養(yǎng)的RAW 264.7細(xì)胞的白光圖和熒光圖的疊加；（d）平均熒光強(qiáng)度直方圖
細(xì)胞對(duì)DNA-SWCNTs的“內(nèi)化”和“外排”
盡管SWCNTs的熒光強(qiáng)度受到濃度和局部環(huán)境的影響，但是SWCNTs的某些特征只和濃度有關(guān)，這就意味著，無(wú)論樣本的熒光強(qiáng)度如何，SWCNTs的手性信息在拉曼圖譜中都可以被表達(dá)出來(lái)。作者使用共聚焦拉曼顯微鏡評(píng)估了SWCNTs在細(xì)胞內(nèi)的局部濃度，首先使用1mg/L的Cy3-(GT)6-SWCNTs或Cy3-(GT)30-SWCNTs培養(yǎng)巨噬細(xì)胞30分鐘，對(duì)0.5μm的微小區(qū)域進(jìn)行拉曼成像。為了計(jì)算出每個(gè)細(xì)胞內(nèi)SWCNTs的質(zhì)量，作者得出了G峰與SWCNTs濃度的特征曲線。Cy3-(GT)6-SWCNTs培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中SWCNTs的起始濃度是Cy3-(GT)30-SWCNTs培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞的兩倍；24 h后，Cy3-(GT)6-SWCNTs培育的巨噬細(xì)胞內(nèi)SWCNTs的濃度下降了75%，而Cy3-(GT)30-SWCNTs培育的巨噬細(xì)胞內(nèi)SWCNTs的濃度下降較小。作者將Cy3-(GT)6-SWCNTs培育的巨噬細(xì)胞內(nèi)SWCNTs的起始濃度高的原因歸結(jié)于單根SWCNTs上的DNA密度較大，這增加了細(xì)胞膜蛋白與DNA相互接觸的概率；相反，也正是由于膜蛋白與DNA接觸概率的增大，從而使得巨噬細(xì)胞可以更快的以胞吐的形式“釋放”SWCNTs。
為了更好的理解胞吐機(jī)制，作者對(duì)細(xì)胞“釋放”(GT)6-SWCNTs的途徑進(jìn)行了探究。作者設(shè)計(jì)了一個(gè)實(shí)驗(yàn)，用巴弗洛霉素A1和諾考達(dá)唑（兩種抑制細(xì)胞溶酶體胞吐作用的化學(xué)藥物）對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行了處理，并比較細(xì)胞內(nèi)DNA-SWCNTs的濃度。結(jié)果顯示，(GT)6-SWCNTs在細(xì)胞內(nèi)的濃度高于對(duì)照組，(GT)30-SWCNTs的濃度與對(duì)照組相比變化不大；相反，用布雷非德菌素A和Exo1（兩種抑制高爾基體分泌的化學(xué)藥物）對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行處理，結(jié)果顯示，(GT)6-SWCNTs和(GT)30-SWCNTs的濃度與對(duì)照組相比差異性較小；這說(shuō)明細(xì)胞主要是通過(guò)溶酶體的胞吐作用來(lái)實(shí)現(xiàn)DNA-CNTs的“釋放”（圖4和圖5）。
圖4：通過(guò)共聚焦顯微鏡確定SWCNTs的濃度；（a）Cy3-(GT)6-SWCNTs和Cy3-(GT)30-SWCNTs培養(yǎng)的RAW 264.7細(xì)胞的G峰強(qiáng)度圖和白光圖（b）從細(xì)胞中ROI區(qū)域像素點(diǎn)計(jì)算得出的SWCNTs的濃度；（c）被細(xì)胞內(nèi)化的SWCNTs的比值；（d）細(xì)胞上清液中外源性SWCNTs的濃度；（e）共聚焦拉曼光譜G峰強(qiáng)度圖與白光圖的疊加；（f）在（e）圖中包含SWCNTs的所有像素點(diǎn)的平均濃度
溶酶體胞吐的主要功能之一是分泌各種生物大分子，如蛋白質(zhì)、酶和抗原，以進(jìn)行細(xì)胞之間的信息傳遞，也可使周?chē)?xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)。有研究表明，對(duì)SWCNTs的表面進(jìn)行修飾可以有效降低對(duì)細(xì)胞的毒性，原始的SWCNTs與細(xì)胞膜上的受體相互作用之后會(huì)被認(rèn)為是一個(gè)有害物質(zhì)。因此，作者認(rèn)為溶酶體將DNA鏈段從DNA-SWCNTs復(fù)合物上去除后，會(huì)使得細(xì)胞將“裸露”的SWCNTs當(dāng)做異物，而引發(fā)細(xì)胞的胞吐作用將其排出，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)SWCNTs的濃度降低；而長(zhǎng)鏈的DNA對(duì)SWCNTs的包覆比較嚴(yán)密，溶酶體無(wú)法將DNA-SWCNTs復(fù)合物上的DNA“剔除”，從而無(wú)法產(chǎn)生胞吐作用，這會(huì)導(dǎo)致(GT)30-SWCNTs在細(xì)胞內(nèi)的滯留。
結(jié)論
作者借助于可見(jiàn)-近紅外高光譜成像和共聚焦拉曼顯微技術(shù)，發(fā)現(xiàn)DNA單鏈的長(zhǎng)度對(duì)DNA-SWCNTs的光學(xué)穩(wěn)定性有影響，通過(guò)調(diào)節(jié)DNA單鏈的長(zhǎng)度可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞“攝入”和“外排”SWCNTs的調(diào)節(jié)；DNA-CNTs上較短的DNA單鏈在溶酶體內(nèi)被細(xì)胞的生物小分子取代，改變了SWCNTs的物理特性和在細(xì)胞內(nèi)的“命運(yùn)”；最后通過(guò)藥物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了細(xì)胞對(duì)SWCNTs的“外排”是通過(guò)胞吐作用。這些發(fā)現(xiàn)有助于人們進(jìn)一步理解SWCNTs與細(xì)胞之間的相互作用，也為后續(xù)科研人員進(jìn)一步探究細(xì)胞對(duì)官能化小分子的“響應(yīng)性”奠定了理論基礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn)
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