2022年4月10日，中山大學(xué)中山眼科中心劉春巧和劉奕志課題組聯(lián)合在美國科學(xué)院院刊PNAS上發(fā)表研究論文“Tmem138 is localized to the connecting cilium essential for rhodopsin localization and outer segment biogenesis”。該研究首次揭示神經(jīng)視網(wǎng)膜光感受器纖毛膜蛋白復(fù)合體在光感分子視紫紅質(zhì)(Rhodopsin)和其他外段蛋白運(yùn)輸及外段形態(tài)發(fā)生過程中的重要作用，從而為色素視網(wǎng)膜炎（Retinitis Pigmentosa，RP）的病理分子機(jī)制提供了必要補(bǔ)充。該項研究同時對纖毛病變引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦水腫的分子機(jī)制提供了重要的參考。

                       

⭐ 研究背景

視網(wǎng)膜色素變性（Retinitis Pigmentosa，RP）是導(dǎo)致失明，影響人類生活質(zhì)量的重要神經(jīng)類型疾病。其中遺傳性RP世界范圍的發(fā)病率約為1：4000，影響我國近三十幾萬人口，目前缺乏有效的治療手段。RP的本質(zhì)是光感受器壞死，視網(wǎng)膜的光感受器（Photoreceptor）分為兩類，分別是負(fù)責(zé)暗視野的視桿細(xì)胞（Rod）和明視野的視錐細(xì)胞（Cone）。Rod數(shù)量約占視網(wǎng)膜95%，絕大部分RP由Rod的壞死引起，導(dǎo)致管狀視野（Tunnel vision），并最終失明。

許多RP與負(fù)責(zé)光感受器外段蛋白運(yùn)輸?shù)幕�因突變密切相關(guān)。外段蛋白運(yùn)輸失敗會導(dǎo)致其在內(nèi)段堆積，使光感受器出現(xiàn)應(yīng)激性細(xì)胞壞死。光感受器在結(jié)構(gòu)上分為外段（Outer segment，OS）、連接纖毛（Connecting cilium，CC）和內(nèi)段（Inner segment，IS）。OS的膜盤結(jié)構(gòu)是光信號級聯(lián)傳導(dǎo)的場所，每天更新約10%，但其本身不具有蛋白和脂類的合成能力。光信號通路蛋白元件需要在IS合成經(jīng)狹窄的CC纖毛橋運(yùn)輸至OS以維持其更新速度。盡管已有很多關(guān)于纖毛在光感受器外段蛋白運(yùn)輸中的功能研究，但這些研究大針對纖毛的微管及相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白，動力蛋白（motors）和囊泡運(yùn)輸復(fù)合體（IFT）的研究，而關(guān)于纖毛膜蛋白在光感受器外段蛋白的運(yùn)輸作用的研究尚為空白。

                           

⭐ 研究材料

體內(nèi)實(shí)驗：通過基因打靶技術(shù)構(gòu)建lox小鼠，通過與Sox2-cre小鼠的雜交得到Tmem138全身性敲除小鼠。（本實(shí)驗所用Tmem138基因敲除小鼠模型由賽業(yè)生物提供）。

體外實(shí)驗：體外培養(yǎng)293T細(xì)胞進(jìn)行Tmem138互作實(shí)驗。

                       

⭐ 技術(shù)方法

01 通過電生理（ERG）及OCT（光學(xué)相干斷層掃描）視網(wǎng)膜成像技術(shù)對不同時期的 Tmem138基因敲除小鼠視網(wǎng)膜的功能及結(jié)構(gòu)進(jìn)行活體檢測。

02 通過HE染色，透射電鏡，免疫電鏡，掃描電鏡的方法對Tmem138基因敲除小鼠視網(wǎng)膜進(jìn)行組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)分析。

03 通過免疫熒光共標(biāo)檢測Tmem138及OS蛋白在視網(wǎng)膜中的定位。

04 通過免疫共沉淀與體內(nèi)視網(wǎng)膜組織pull down實(shí)驗尋找Tmem138蛋白的互作蛋白。

                           

⭐ 技術(shù)路線

                                                 

⭐ 研究結(jié)果

1. Tmem138基因敲除小鼠模型的構(gòu)建及表型分析

劉春巧課題組一直關(guān)注神經(jīng)視網(wǎng)膜的發(fā)育和遺傳疾病的研究。前期對調(diào)控纖毛發(fā)育和細(xì)胞極性運(yùn)輸?shù)腤nt/PCP信號通路進(jìn)行了研究（Guo et al., 2018; IOVS and EXP EYE RES; Guo et al., 2020, IOVS and Development）并發(fā)現(xiàn)了幾個受Prickle1調(diào)節(jié)的跨膜蛋白。其中TMEM138突變會引起Joubert綜合癥并伴隨視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良。為了研究TMEM138突變引發(fā)視網(wǎng)膜疾病的分子機(jī)理，作者首先構(gòu)建了具有Joubert綜合癥表型的Tmem138基因敲除小鼠模型（Tmem138基因敲除小鼠模型由賽業(yè)生物有限公司提供），該品系小鼠具有腦室擴(kuò)張，精子發(fā)生障礙及視網(wǎng)膜退行性變性等與Joubert病人相似的表型（圖1）。

圖1：Tmem138缺失導(dǎo)致腦室擴(kuò)張，精子缺失癥以及視網(wǎng)膜退行性疾病

                             

2. Tmem138膜蛋白在光感受器細(xì)胞的定位分析

接下來，作者通過多重免疫熒光的分子標(biāo)記，區(qū)分纖毛外段的不同區(qū)域，并通過基因敲除小鼠驗證，確立了Tmem138定位于連接纖毛的近端（圖2）。

圖2：Tmem138定位于連接纖毛

                            

3. Tmem138基因敲除導(dǎo)致纖毛胞質(zhì)蛋白Ahi1在CC遠(yuǎn)端缺失

因為Tmem138定位于連接纖毛，作者探究了光感受器纖毛組分是否發(fā)生改變，作者分別檢測了纖毛基體（Cep164），連接纖毛（Ahi1），軸絲（Rp1）以及IFT蛋白運(yùn)輸組分（Ift88，Kif3A）變化，發(fā)現(xiàn)Tmem138缺失后能導(dǎo)致OS發(fā)育早期（P5）連接纖毛蛋白Ahi1的顯著改變（圖3）。

圖3：Tmem138缺失導(dǎo)致連接纖毛Ahi結(jié)構(gòu)改變

                          

4. Tmem138缺失未導(dǎo)致纖毛結(jié)構(gòu)性改變

接著，作者繼續(xù)探究了Ahi1纖毛蛋白的改變是否是由于其纖毛結(jié)構(gòu)破壞所致，掃描電鏡（SEM）和透射電鏡（TEM）的結(jié)果顯示Tmem138缺失后光感受器纖毛結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化（圖4）。

圖4：SEM和TEM顯示光感受器纖毛結(jié)構(gòu)

                       

5. Tmem138基因敲除小鼠表現(xiàn)出早發(fā)且快速的視網(wǎng)膜退化

為了進(jìn)一步了解Tmem138在OS生物發(fā)生中的作用，作者檢測了光感受器從P3到P14發(fā)育過程中視紫紅質(zhì)的表達(dá)和定位，發(fā)現(xiàn)Tmem138敲除后視紫紅質(zhì)最早從第5天開始在內(nèi)段堆積（圖5）。

圖5：Tmem138缺失導(dǎo)致光感受器外段發(fā)育異常

                               

6. Tmem138/Tmem231/Ahi1纖毛復(fù)合體介導(dǎo)Rhodopsin跨纖毛運(yùn)輸

作者繼續(xù)探究了Tmem138介導(dǎo)光感受器外段發(fā)生的機(jī)制，通過免疫共沉淀和視網(wǎng)膜pull down實(shí)驗，作者發(fā)現(xiàn)Tmem138可以與兩個JBTS蛋白（Ahi1和Tmem231）以及視紫紅質(zhì)相互作用。因此作者做了一個假設(shè)的模型：即位于連接纖毛膜基部的Tmem138形成Tmem138/Tmem231/Ahi1復(fù)合體對CC部位分子組裝至關(guān)重要，這種Tmem138復(fù)合體與視紫紅質(zhì)相互作用，以促進(jìn)其在不同馬達(dá)蛋白驅(qū)動下沿者微管或微絲結(jié)構(gòu)進(jìn)行運(yùn)輸。Tmem138的缺失可導(dǎo)致Ahi1和Tmem231定位錯誤，最終阻礙了視紫紅質(zhì)以及其他OS蛋白通過CC（圖6）。 

                           

⭐ 總結(jié)

該研究首次揭示神經(jīng)視網(wǎng)膜光感受器纖毛膜蛋白復(fù)合體在視紫紅質(zhì)和其他外段蛋白運(yùn)輸中起到的重要作用，從而為RP的病理分子機(jī)制提供了必要補(bǔ)充。該項研究同時對纖毛病變引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦水腫的分子機(jī)制提供了重要的參考。

                      

⭐ 補(bǔ)充說明

該項目研究得到了國家自然科學(xué)基金，廣州市科技創(chuàng)新項目及中山大學(xué)百人計劃的支持。中山大學(xué)中山眼科中心、眼科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室為第一單位。郭佃磊博士后和汝佳麗博士是本論文的第一作者，劉春巧研究員和劉奕志教授是本論文通訊作者。

                               

⭐ 參考文獻(xiàn)：

GUO D, RU J, XIE L, et al. Tmem138 is localized to the connecting cilium essential for rhodopsin localization and outer segment biogenesis [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2022, 119(15): e2109934119.