腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）是一類單鏈線性DNA缺陷型病毒。通過對AAV進行工程化改造，科學家已經(jīng)制造出了適合用于細胞轉(zhuǎn)染的重組AAV載體（rAAV，即recombinant AAV）。它們具有免疫原性低、靶向性強、宿主范圍廣和可長期穩(wěn)定地表達外源基因等特點，因此被科研人員廣泛應用于基因功能研究的體內(nèi)基因操作實驗。近年來備受關注的基因治療領域，它最重要的遞送載體是rAAV。rAAV的生產(chǎn)與制備是基因治療中的一個重要環(huán)節(jié)和難點，這是因為rAAV的包裝體系和純化方法等條件均會影響侵染效率和目的基因的表達效率，最終影響使用的效果。因此，對rAAV進行質(zhì)檢是一個重要的環(huán)節(jié)。下面給大家介紹rAAV包裝生產(chǎn)后的必要質(zhì)檢項目。

一、rAAV的生產(chǎn)體系
rAAV的包裝生產(chǎn)一般使用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，可大致分為以下四個步驟：目的序列制備并克隆至載體、病毒包裝、收毒與純化濃縮、質(zhì)檢。

圖 1 rAAV生產(chǎn)流程

 

二、rAAV的質(zhì)檢

rAAV的質(zhì)量對后續(xù)的體內(nèi)實驗有著重要的影響，這包括判別rAAV是否具備生物活性和rAAV用量等。因此需要對每批新產(chǎn)的rAAV進行質(zhì)檢。質(zhì)檢通常包括滴度檢測、衣殼蛋白純度檢測、基因組大小及純度檢測和生物學活性檢測等。

 

✔ 滴度檢測

滴度檢測指檢測rAAV的基因拷貝數(shù)，計算每ml病毒液的病毒顆粒中含有的基因組拷貝總數(shù)。具有多種檢測的手段，包括DNA斑點雜交（dot-blotting）、ELISA、qPCR和ddPCR等，通常使用絕對定量的方法。首先通過建立標準曲線，得知標準品DNA含量與CT值的線性關系。在此基礎上，檢測出rAAV病毒的CT值，便可以得到病毒的滴度。

 

✔ 病毒基因組大小及純度檢測

rAAV基因組鑒定較為簡單，只需要提取rAAV的基因組，再進行瓊脂凝膠電泳即可。由于我們已經(jīng)知道目的序列和兩端ITR的整個rAAV基因組大小，所以從電泳結果便可以判別出rAAV是否包含我們目的的片段，此外還能得知是否存在不正確的核酸序列或雜質(zhì)。

以賽業(yè)生物的數(shù)據(jù)為例，我們包裝了多個含有不同目的序列的rAAV2和rAAV8。提取rAAV病毒基因組后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，可以看到各種組合的基因組大小均符合預期，并且無其他雜帶，這樣便能說明rAAV基因組大小及純度是合格的。

圖 2 病毒基因組大小及純度檢測

（數(shù)據(jù)來源：賽業(yè)生物）

Line1：rAAV2-CMV-EGFP (20220217）1E+10 (ITR滴度）2623bp

Line2：rAAV8-CMV-luc(C+S)(20220225) 1E+10(ITR滴度)3464bp

Line3：rAAV8-CMV-EGFP(C+S)(20220225） 1E+10(ITR滴度）2623p

Line4：rAAV2-IRES-hrGFP(20210907)1E+10(ITR滴度)3544bp

Line5：rAAV2-CMV-EGFP(20220217）2E+10(ITR滴度)2623bp

Line6：rAAV8-CMV-luc(C+S) (20220225) 2E+10(ITR滴度)3464bp

Line7：rAAV8-CMV-EGFP(C+S)(20220225）2E+10(ITR滴度）2623bp

Line8：rAAV2-IRES-hrGFP(20210907) 2E+10(ITR滴度)3544bp

 

✔ rAAV衣殼蛋白檢測

由于rAAV衣殼蛋白決定了rAAV的感染效力，所以在檢測rAAV基因組過后還需檢測衣殼蛋白純度。推薦使用商業(yè)化蛋白提取試劑盒，用于提取rAAV的衣殼蛋白，然后再通過SDS-PAGE 考染/銀染檢測方法，檢測rAAV衣殼蛋白的純度。優(yōu)質(zhì)rAAV的衣殼VP1、VP2、VP3的分子量大小分別為87KD、72KD、62KD，且數(shù)量比約為1：1：10。

以賽業(yè)生物的數(shù)據(jù)為例，我們包裝了多個含有不同目的序列的rAAV8和rAAV9。在提取不同組合的rAAV衣殼蛋白后，分別進行考染和銀染。從結果可以看出，不同組合的rAAV衣殼蛋白大小均符合預期，并且VP1、VP2、VP3的條帶亮度也符合1：1：10。此外也不存在雜帶，所以這個結果是可以說明包裝出的rAAV衣殼蛋白純度較高，間接說明各組rAAV應具備較高的感染活性。

圖 3 病毒衣殼蛋白純度檢測

（數(shù)據(jù)來源：賽業(yè)生物）

SDS-PAGE考染：Lane1：rAAV9-CMV-EGFP，3E11vg；Lane2：rAAV9-CMV-Luc，3E11vg；Lane3：rAAV8-CMV-EGFP，3E11vg；Lane4：rAAV8-CMV-Luc，3E11vg；Lane5：rAAV9-CMV-EGFP，1.5E11vg。

SDS-PAGE銀染：Lane1：rAAV2-IRES-hrGFP，9E10vg；Lane2：rAAV2-IRES-hrGFP，4.5E10vg；Lane3：rAAV2-IRES-hrGFP，1.5E10vg。

 

✔ 生物學活性檢測

生物學活性檢測是指使用rAAV感染293T等細胞，檢測rAAV的侵染效率。常用的檢測手段是在rAAV中包裝一個熒光蛋白，在轉(zhuǎn)染293T細胞后，通過熒光亮度直觀地指示rAAV的侵染效率。此外，還能通過流式檢測獲得更為嚴謹?shù)臄?shù)據(jù)。

以賽業(yè)生物的數(shù)據(jù)為例，我們用不同類型不同濃度的rAAV感染293T細胞，通過觀察熒光和流式檢測，鑒定rAAV的感染效率。在熒光強度觀察中，rAAV2、rAAV8、rAAV9以MOI=1E5侵染293T細胞，48h后能觀察到強烈的熒光信號。

圖 4 rAAV感染293T細胞后48h熒光觀察（數(shù)據(jù)來源：賽業(yè)生物）

 

在流式檢測中，rAAV2、rAAV8、rAAV9分別以MOI=1E5、1E4、1E3、1E2侵染293T細胞。組合rAAV2-MOI=1E5的GFP陽性率達到99.66%，并且其他的組合也有較高的GFP陽性率。說明包裝出的rAAV具有很強的侵染能力。

圖 5 rAAV感染293T細胞流式檢測

（數(shù)據(jù)來源：賽業(yè)生物）

三、小結
rAAV的質(zhì)量對于后續(xù)的使用有著重要的影響，為了確保后續(xù)實驗可以順利進行，那么在rAAV生產(chǎn)質(zhì)檢這一環(huán)節(jié)就需要嚴格把關，以多種指控標準進行檢測，務求生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的rAAV。