生物創(chuàng)新藥的開發(fā)是一個(gè)復(fù)雜的過程，而構(gòu)建一個(gè)適合于生產(chǎn)的高表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株是第一步，也是關(guān)鍵的一步。挑選到理想的高表達(dá)克隆后，就要開始選擇商業(yè)化培養(yǎng)基或者定制培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)化。高通量、標(biāo)準(zhǔn)化、自動化的細(xì)胞培養(yǎng)和工藝優(yōu)化能幫助我們在獲得更準(zhǔn)確結(jié)果的同時(shí)加速細(xì)胞株開發(fā)進(jìn)度。

Ambr® 15 高通量全自動細(xì)胞培養(yǎng)
Ambr®15細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)是全球?qū)嶒?yàn)室普遍應(yīng)用的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)微型生物反應(yīng)器系統(tǒng)。作為一個(gè)自動化、高通量的一次性生物反應(yīng)器系統(tǒng)，其能夠以10-15mL的體積模擬大規(guī)模生物反應(yīng)器所提供的功能和工藝控制。該系統(tǒng)兼具并行處理能力和卓越的重現(xiàn)性，可快速實(shí)現(xiàn)包括實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(DOE)研究在內(nèi)的高通量工藝優(yōu)化，可有效縮短時(shí)間、減少試劑使用量并節(jié)省人工成本。

Octet® 非標(biāo)記分子互作分析系統(tǒng)
Octet®系統(tǒng)采用非標(biāo)記、無流路的生物層干涉（BLI）技術(shù)，采用浸入即讀的檢測方式，是列入美國藥典的分子相互作用檢測標(biāo)準(zhǔn)�；�于生物層干涉技術(shù)原理，通過監(jiān)測生物傳感器表面的生物分子結(jié)合所帶來的膜層厚度變化來檢測分子間相互作用的動力學(xué)變化或者濃度數(shù)據(jù)。該系統(tǒng)在生命科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛。這些領(lǐng)域包括受體與抗體、病毒顆粒、重組蛋白和許多其他生物分子結(jié)合的動力學(xué)和親和力常數(shù)分析。

本應(yīng)用中，介紹了如何使用Ambr® 15高通量全自動細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和Octet®非標(biāo)記分子互作分析系統(tǒng)聯(lián)合進(jìn)行培養(yǎng)基篩選和工藝優(yōu)化，加速細(xì)胞株開發(fā)工作流程，以最快速度篩選出高產(chǎn)量高質(zhì)量的單克隆細(xì)胞株（圖1）。
 
實(shí)驗(yàn)1
  Ambr® 15細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)

生物反應(yīng)器溫度：36.8℃ 接種細(xì)胞密度：3E5cells/mL 培養(yǎng)體積：13mL PH：7.0(上限為7.1) DO：40% 壓載氣體流速：0.15mL/min 攪拌速度：1300rpm 每天添加消泡劑和補(bǔ)料（見圖2）

圖2

 
Octet®中的產(chǎn)量(滴度)測定 

儀器機(jī)型：Octet® R8 傳感器類型：ProteinA/ ProteinG 定量時(shí)間：120s 樣品板溫度: 30℃

 
在本實(shí)驗(yàn)中，2個(gè)克隆在5種不同培養(yǎng)基中使用XR進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，同時(shí)使用Octet®進(jìn)行滴度測定。

結(jié)果與討論

本應(yīng)用通過對兩個(gè)不同的克隆進(jìn)行五種不同的培養(yǎng)基組合評估，證明了聯(lián)合使用Ambr® 15和Octet®在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行多種條件的便利、簡單和速度。

克隆1的結(jié)果（圖3）表明，五個(gè)培養(yǎng)基中活細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞活率基本一致，培養(yǎng)基3和培養(yǎng)基5中的最高細(xì)胞密度略高。產(chǎn)品滴度結(jié)果（圖3B）表明，培養(yǎng)基5是生產(chǎn)mAb表現(xiàn)最好的培養(yǎng)基。這與細(xì)胞特定生產(chǎn)率（Qp）（圖3D）結(jié)果完全一致。
  圖3. 克隆1在不同培養(yǎng)基中的細(xì)胞計(jì)數(shù)和滴度分析。使用XR進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，同時(shí)使用Octet®進(jìn)行高通量滴度測定。

克隆2的結(jié)果（圖4）顯示，在五種培養(yǎng)基中，細(xì)胞生長情況相當(dāng)，直到第6天以后，培養(yǎng)基1和培養(yǎng)基2中的活細(xì)胞密度峰值和細(xì)胞活率都超過了其他培養(yǎng)基。對于這個(gè)克隆，培養(yǎng)基3、4和5中的細(xì)胞活率從第8天起就開始下降。培養(yǎng)基1和培養(yǎng)基2中都有較高的產(chǎn)品滴度，但總體而言，培養(yǎng)基2在第8天后具有較高的生產(chǎn)力，導(dǎo)致較高的Qp（細(xì)胞特定生產(chǎn)率）數(shù)值（圖4D）。
  圖4. 克隆2在不同培養(yǎng)基中的細(xì)胞計(jì)數(shù)和滴度分析。使用XR進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，同時(shí)使用Octet®進(jìn)行高通量滴度測定。

兩個(gè)克隆的比較表明，克隆2達(dá)到的最大產(chǎn)品滴度是克隆1最大滴度的兩倍以上。然而，如果選擇培養(yǎng)基5作為最佳培養(yǎng)基，那么結(jié)果表明克隆2具有較低的性能，因?yàn)榕囵B(yǎng)基5與該克隆組合時(shí)的生產(chǎn)率較低。因此，不應(yīng)低估一起篩選多個(gè)克隆和不同培養(yǎng)基類型的影響，因?yàn)楫a(chǎn)品性能會有很大的不同。

實(shí)驗(yàn)2
   
Ambr® 15細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)
生物反應(yīng)器溫度：36.8℃
接種細(xì)胞密度：3E5cells/mL
培養(yǎng)體積：12~14 mL
PH：7.0(上限為7.1)
DO：40%
壓載氣體流速：0.05~0.25mL/min
攪拌速度：1050~1650rpm
每天添加消泡劑和補(bǔ)料

Octet®中的產(chǎn)量(滴度)測定

儀器機(jī)型：Octet® RH96 傳感器類型：ProteinA/ ProteinG 定量時(shí)間：120s 樣品板溫度:30℃

在本實(shí)驗(yàn)中，攪拌速度、壓載氣體流速和起始體積是一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中可變的所有因素。我們通過MODD®軟件設(shè)置DOE。
 

工藝參數(shù)	范圍
攪拌速度	1050 - 1650 rpm
通氣速率（空氣）	0.05 - 0.25 mL/ min
起始體積	12 - 14 mL
響應(yīng)	Qp（細(xì)胞特異性生產(chǎn)率）

結(jié)果與討論

本研究利用Ambr® 15中的DOE MODDE®軟件快速建立一個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，改變相關(guān)生物工藝條件。在整個(gè)過程中使用Octet® 檢測產(chǎn)量(滴度)，可立即進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，并對項(xiàng)目安排產(chǎn)生積極影響。

響應(yīng)輪廓圖（圖5）顯示了攪拌速度和通氣速率組合如何影響Qp。在低速攪拌時(shí)，增加通氣（空氣）的流速有一個(gè)微小的但積極的影響，當(dāng)攪拌速度增加到1200 rpm時(shí)，氣體的流速似乎沒有影響。然而，在最高的攪拌速度下，其實(shí)際上對Qp有不利的影響，較低的氣體流速是可取的�？偟膩碚f，在較高的攪拌速度和較低的氣體流速下，可看到最高的細(xì)胞特定生產(chǎn)率。
主效應(yīng)圖是一個(gè)單一工藝變量的各個(gè)水平下的平均響應(yīng)值的圖。本研究中攪拌速度的主效應(yīng)圖（圖6A）表明隨著攪拌速度提高到約1500rpm，之后細(xì)胞特異性生產(chǎn)率趨于平穩(wěn)。雖然在較高的攪拌速度下獲得了最大的Qp，但對于這個(gè)特定的克隆，較高的攪拌速度產(chǎn)生了較強(qiáng)的剪切力，細(xì)胞活率也會下降很快。起始體積的主效應(yīng)圖（圖6B）顯示，較低的培養(yǎng)體積提供了較高的Qp（每個(gè)細(xì)胞的收率較高）。在Ambr®15細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，頂空體積和液體體積之間的界面面積對整個(gè)罐體kLa的貢獻(xiàn)比大型生物反應(yīng)器要大。此外，較低的工作容積，在相同的攪拌速度下，單位體積的功率輸入上升，這意味著直接用于破壞和促進(jìn)氣泡在液體中懸浮的能量輸入更大，這也將對kLa做出重要貢獻(xiàn)。因此，在工藝優(yōu)化過程中，必須仔細(xì)考慮培養(yǎng)體積與其他參數(shù)的關(guān)系。
  圖6. （A）攪拌速度和（B）起始體積的細(xì)胞特定生產(chǎn)率（Qp）的主效應(yīng)圖。在MODDE®軟件中進(jìn)行分析。

總結(jié)
Ambr® 15高通量全自動細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)集成了XR和Ambr® 分析模塊，功能強(qiáng)大；Octet®高通量分子互作分析系統(tǒng)，在培養(yǎng)基篩選和工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中快速確定最佳收率條件，與全新推出的Octet® GlyS和GlyM試劑盒相結(jié)合，還可評估關(guān)鍵質(zhì)量屬性。加速整個(gè)細(xì)胞株開發(fā)流程，為新藥上市賦能。

二者的主要優(yōu)勢有：

• 實(shí)驗(yàn)流程簡化，具備并行篩選多種條件的能力；
• 控制性能提升，包括pH和DO在內(nèi)的工藝參數(shù)；
• 樣品無需處理，大大縮短了分析時(shí)間，Octet® RH96上可在5分鐘內(nèi)獲得多達(dá)96個(gè)樣品檢測；
• 工藝優(yōu)化中，證實(shí)了Octet®與Ambr®15在MODDE®軟件上聯(lián)合使用是評估各種參數(shù)的理想組合。

下載
下載應(yīng)用指南《高效細(xì)胞株開發(fā)：結(jié)合Ambr® 15 細(xì)胞培養(yǎng)與Octet® 滴度測定加速工藝優(yōu)化》了解更多高效細(xì)胞株開發(fā)策略