在血清樣品中通過化學發(fā)光免疫實驗檢測新冠 IgG 抗體
簡介
作為新冠病毒免疫反應的一部分，感染者體內會產生病毒特異性抗體，在出現癥狀后的一至三周內，這些抗體可以在血液中被檢測到。IgG 和 IgM 幾乎同時出現，而 IgG 在更長時間內維持一個高水平。在血清中，由于感染病毒或接種疫苗而產生的可檢測到的抗體可以防范將來被新冠病毒感染。但這些抗體持續(xù)的時間長短和提供保護的程度是有關新冠病毒仍需密切調查的眾多問題之一。
在人體血清中，通過免疫實驗來檢測新冠抗體是增進我們了解這種疾病以及疫苗研究的重要工具。Promega LumitTMDx SARS-CoV-2 免 疫 實 驗 使 用了 帶 有 SmBiT 和 LgBiT ( 這是 NanoLuc 熒光素酶的兩個亞基，只有當它們通過結合相互靠近時，才具有功能 ) 標記的新冠病毒刺突蛋白受體結合區(qū)域(RBD) 的一個片段。當這些標記過的病毒蛋白片段與含有新冠病毒抗體的樣品一起孵育時，他們將與抗體結合，將 SmBiT和 LgBiT 兩個亞基結合到一起，并產生功能性的熒光素酶。添加 Lumit 檢測試劑，在微孔板光度計上測量產生的熒光信號。
Lumit 實驗中，樣品的添加和測讀如圖 1 所示。沒有清洗的步驟并且一小時內測得結果，使得這個實驗可以應用于高通量篩選。SpectraMax iD5 多功能酶標儀具有超冷光電倍增管(PMT)，可以為 Lumit Dx 新冠病毒免疫實驗提供高靈敏度的發(fā)光檢測。
優(yōu)點
•放大高通量篩選，省去清洗步驟，
•樣品體積僅需 15 微升，
•樣品體積僅需 15 微升，
• 一小時內測得結果。
圖 1 Lumit Dx 新冠病毒免疫實驗的工作流程。添加 - 孵育 - 測讀全流程將在一小時內完成，并且可以用于自動化和高通量篩選。
材料
材料
• Lumit Dx 新冠病毒免疫實驗試劑盒 (Promega cat. #VB1080)
• 新冠病毒陽性血清樣品 (BioIVT cat. #HMSRM-COVID)
• 正常人血清 (Amsbio cat. #HSER-2mL)
• 白色 96 孔板 (Greiner cat. #655075)
• SpectraMax iD5 多功能酶標儀 ( 美谷分子儀器 )
方法
實驗試劑的準備和微孔板的操作如下 ( 更多的細節(jié)， 請參閱Lumit Dx 新冠病毒免疫實驗技術手冊)：
方法
實驗試劑的準備和微孔板的操作如下 ( 更多的細節(jié)， 請參閱Lumit Dx 新冠病毒免疫實驗技術手冊)：
1.
制備 1x Lumit-Dx 免 疫 實 驗 稀 釋 緩 沖 液 ( 添 加 5mL 10xLumit-Dx 免 疫 實 驗 稀 釋 緩 沖 液 至 45 mL Lumit-Dx PBS/EGTA 溶液中 )。
制備 1x Lumit-Dx 免 疫 實 驗 稀 釋 緩 沖 液 ( 添 加 5mL 10xLumit-Dx 免 疫 實 驗 稀 釋 緩 沖 液 至 45 mL Lumit-Dx PBS/EGTA 溶液中 )。
2.
來源于新冠患者或健康受試者的30 uL 血清樣本， 與 70 uL1x Lumit-Dx 免疫實驗稀釋緩沖液混合。 有足夠的體積進行三次實驗； 通常每個孔僅需 15 uL 樣品。
來源于新冠患者或健康受試者的30 uL 血清樣本， 與 70 uL1x Lumit-Dx 免疫實驗稀釋緩沖液混合。 有足夠的體積進行三次實驗； 通常每個孔僅需 15 uL 樣品。
3.
Lumit-Dx CoV-2 BiTs Master Mix 現 配 現 用， 配 方 如 下：5mL 1x Lumit-Dx 免疫實驗稀釋緩沖液、9.4 uL Lumit-DxCoV-2 LgBiT( 紅色蓋子 )、9.4 uL Lumit-Dx CoV-2 SmBiT( 藍色蓋子 )。 添加完畢后， 輕微地顛倒混勻。
Lumit-Dx CoV-2 BiTs Master Mix 現 配 現 用， 配 方 如 下：5mL 1x Lumit-Dx 免疫實驗稀釋緩沖液、9.4 uL Lumit-DxCoV-2 LgBiT( 紅色蓋子 )、9.4 uL Lumit-Dx CoV-2 SmBiT( 藍色蓋子 )。 添加完畢后， 輕微地顛倒混勻。
4.
Lumit-Dx 陽性對照、Lumit-Dx 陰性對照、Lumit-Dx 實驗校準試劑， 解凍后放置于室溫及時使用。 簡短的離心可使管壁內容物甩至管底。
結果
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Lumit-Dx 陽性對照、Lumit-Dx 陰性對照、Lumit-Dx 實驗校準試劑， 解凍后放置于室溫及時使用。 簡短的離心可使管壁內容物甩至管底。
5.
按如下操作， 添加試劑至白色 96 孔板中：
按如下操作， 添加試劑至白色 96 孔板中：
• 每個孔加入 40uL Lumit CoV-2 BiTs Master Mix，
• 20uL 稀釋的病人血清樣本， 三個重復，
• 20uL Lumit-Dx 陽性對照， 三個重復，
• 20uL Lumit-Dx 陰性對照， 三個重復，
• 20uL Lumit-Dx 實驗校準試劑， 三個重復，
6.
將微孔板封蓋， 室溫孵育 20 分鐘。
將微孔板封蓋， 室溫孵育 20 分鐘。
7.
孵育后， 制備 Lumit-Dx 檢測試劑 (7mL 1x Lumit-Dx 免疫實驗稀釋緩沖液、230 uL Lumit-Dx 檢測底物 ( 灰色蓋子 )，現配現用。 輕微地顛倒混勻。
孵育后， 制備 Lumit-Dx 檢測試劑 (7mL 1x Lumit-Dx 免疫實驗稀釋緩沖液、230 uL Lumit-Dx 檢測底物 ( 灰色蓋子 )，現配現用。 輕微地顛倒混勻。
8.
60 uL 檢測試劑加入孔中， 室溫孵育 3 分鐘。
60 uL 檢測試劑加入孔中， 室溫孵育 3 分鐘。
9.
使用 SpectraMax iD5 讀板機測讀， 如表 1 所設置。 測讀完成后， 相對發(fā)光單位 (RLUs) 顯示在 SoftMax Pro 軟件的plate 板塊中。 在模板中， 這些孔被分配到不同的組中，各組產生的表單被用于計算和顯示數據結果。
實驗的質控按照試劑盒技術手冊進行評估。 Lumit-Dx 實驗校準試劑、Lumit-Dx 陽性對照、Lumit-Dx 陰性對照都被用于確保最合適的實驗性能。 相比于 Lumit-Dx 實驗校準試劑， 陽性對照必須產生更高的相對發(fā)光單位值， 陰性對照必須產生更低的相對發(fā)光單位值。 如果這些條件不滿足， 微孔板測讀結果將是無效的。
使用 SpectraMax iD5 讀板機測讀， 如表 1 所設置。 測讀完成后， 相對發(fā)光單位 (RLUs) 顯示在 SoftMax Pro 軟件的plate 板塊中。 在模板中， 這些孔被分配到不同的組中，各組產生的表單被用于計算和顯示數據結果。
實驗的質控按照試劑盒技術手冊進行評估。 Lumit-Dx 實驗校準試劑、Lumit-Dx 陽性對照、Lumit-Dx 陰性對照都被用于確保最合適的實驗性能。 相比于 Lumit-Dx 實驗校準試劑， 陽性對照必須產生更高的相對發(fā)光單位值， 陰性對照必須產生更低的相對發(fā)光單位值。 如果這些條件不滿足， 微孔板測讀結果將是無效的。
表 1 Lumit-Dx 實驗中，SpectraMax iD5 讀板機儀器參數設置。全波長 ( 無波長選項 ) 設置被用于最大化的發(fā)光檢測。讀板高度在 SoftMaxPro 軟件中的讀板高度調整設置之前進行了優(yōu)化。
結果
實驗結果通過每一個測試樣品 (S) 的相對發(fā)光單位 (RLU) 與實驗校準試劑 (C) 的平均相對發(fā)光單位的比值計算得到。 S/C 比值≥ 1， 樣品中新冠抗體為陽性；S/C 比值＜ 1， 樣品中新冠抗體為陰性。 實驗校準試劑的平均相對發(fā)光單位是 548， 六位新冠患者樣本的平均相對發(fā)光單位從 1787 至 14155 不等， 健康受試者的相對發(fā)光單位是 86。
如表 2 顯示， 新冠患者樣本的比值都是大于 1， 顯示陽性結果， 而健康受試者的比值都是小于 1， 顯示陰性結果。
備注： 此實驗樣品板也在 SpectraMax i3X, SpectraMax M5,SpectraMax L 酶標儀上測讀， 獲得相似的結果。
表 2 在 SpectraMax iD5 讀板機上獲得的 Lumit Dx 新冠病毒實驗檢測結果。所有的樣品和實驗對照都有三次重復，并計算出變異系數 CV值。運用 SoftMax Pro 軟件計算并分析實驗結果。
結論
研究人員通過檢測大量的新冠病毒感染患者和已接種疫苗的人的血清樣本， 進一步了解免疫反應發(fā)生和持續(xù)的時間， 因此，大量的血清樣本新冠抗體的快速檢測變得尤為迫切。 Lumit Dx新冠病毒免疫實驗為科學家提供了一個簡化的流程， 可以更快速地獲得結果。 聯合使用 SpectraMax iD5 讀板機和 SoftMaxPro 軟件， 實驗數據的計算和分析更加自動化， 減少手動操作時間， 可以有更高的通量。
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參考文獻
1. Post N, Eddy D, Huntley C et al. Antibody response to
SARS-CoV-2 infection in humans: A systematic review. PLoS
ONE 15(12):e0244126 (2020)
2. Long QX, Liu BZ, Deng HJ et al. Antibody responses to
SARS-CoV-2 in patients with COVID-19. Nat Med 26, 845–848
(2020).
