利用近紅外標(biāo)記和圖像及數(shù)據(jù)分析提高Cell Painting的可靠性

瀏覽次數(shù)：2309　發(fā)布日期：2022-4-14　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

簡(jiǎn)介

基于圖像的表型分析方法，如廣泛使用的 Cell Painting分析，使用高內(nèi)涵成像和多參數(shù)輸出來研究細(xì)胞中的生物、遺傳和化學(xué)擾動(dòng)。這種日益流行的方法正被應(yīng)用于從藥物發(fā)現(xiàn)項(xiàng)目到基因組篩選研究。在標(biāo)準(zhǔn)的 Cell Painting 實(shí)驗(yàn)中，各種細(xì)胞器和結(jié)構(gòu) ( 細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞骨架、胞質(zhì) RNA 和核仁 ) 在 5 個(gè)成像通道中被采集。這種廣泛的細(xì)胞染色能夠以單細(xì)胞分辨率對(duì)多種形態(tài)的擾動(dòng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)和定量。已發(fā)表的 Cell Painting 分析的局限性包括適合的染料可用性狹窄以及成像系統(tǒng)提供足夠的光譜分離能力。具體來說，高爾基體和肌動(dòng)蛋白是通過同一通道成像的，這就給圖像分析中區(qū)分這兩個(gè)結(jié)構(gòu)帶來了挑戰(zhàn)。這種限制可能會(huì)干擾 hit 的選擇或掩蓋某些化合物的效果，特別是那些具有影響高爾基體 ( 生物合成途徑 ) 或細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)的作用機(jī)制 (MOA) 的化合物。

優(yōu)勢(shì)

• 使用近紅外標(biāo)記提高 Cell Painting 分析的靈敏度。

• 使用 IN Carta 的深度學(xué)習(xí) SINAP 模塊獲得可靠的圖像分割。

• 結(jié)合 StratoMineR 的基于云的數(shù)據(jù)分析軟件易于使用。

在這里，我們?cè)噲D利用配備近紅外光源的 ImageXpressConfocal HT. ai 高內(nèi)涵成像系統(tǒng)來改進(jìn)檢測(cè)方法。我們將 Alexa Fluor 568 Phalloidin 替換為 Alexa Fluor 750Phalloidin，使細(xì)胞骨架與高爾基區(qū)域明顯分離。

由于這種多色分析的復(fù)雜性，從這些圖像分析中產(chǎn)生的龐大數(shù)據(jù)需要額外的分析工具來幫助挖掘和解釋數(shù)據(jù)。為了便于管理圖像和數(shù)據(jù)分析，我們使用 IN Carta 圖像分析軟件進(jìn)行特征提取，然后使用 HC StratoMineR 進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘和分析。IN Carta 具有深度學(xué)習(xí)功能，允許更可靠的特征分割。因此，當(dāng)與深度學(xué)習(xí)的 SINAP 模塊一起使用時(shí)，Cell Painting 分析將受益于改進(jìn)的細(xì)胞核檢測(cè)。此外，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和細(xì)胞骨架等細(xì)胞器可以在需要時(shí)使用深度學(xué)習(xí)功能進(jìn)一步分割�？梢詮姆治龅�

圖像中提取包含熒光強(qiáng)度、空間數(shù)值、紋理、細(xì)胞器分布和共定位測(cè)量。然后將數(shù)據(jù)上傳到 HC StratoMineR，這是一個(gè)直觀的基于云的數(shù)據(jù)分析平臺(tái)，用于進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析。為了確定我們的方法是否比標(biāo)準(zhǔn)的 Cell Painting方法有任何優(yōu)勢(shì)，我們比較了用 5 通道獲得的圖像和用 6通道獲得的圖像之間的表型距離得分。

我們發(fā)現(xiàn)，用一組化合物處理的細(xì)胞的距離得分提高了49%。這些結(jié)果表明，對(duì)高爾基體和細(xì)胞骨架使用單獨(dú)的成像通道增加了 Cell Painting 實(shí)驗(yàn)的敏感性，并更有力的代表了不同的細(xì)胞表型特征。

方法

1. U2OS 細(xì)胞 (ATCC) 以每孔 2000 個(gè)細(xì)胞接種。

2.在四個(gè)復(fù)孔中，以 7 個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn) 1:3 系列稀釋和合適的對(duì)照品對(duì) 11 種化合物進(jìn)行了測(cè)試。使用的化合

物 :Ca-074-Me、CCCP、氯喹、細(xì)胞松弛素 D、依托泊苷、拉春庫林 B、雷帕霉素、魚藤酮、十字孢堿、紫杉醇、粉防己堿。

3.細(xì) 胞染色采用 Bray 等人的方法¹ 。對(duì) 于改進(jìn) 的方案，使用 phalloidin/Alexa Fluor Plus 750 (ThermoFisher) 代替 phalloidin/Alexa Fluor 568。

4.圖像采集在使用 20X Plan Apo 物鏡的 ImageXpressConfocal HT.ai ( 基于激光 ) 或者 ImageXpress MicroConfocal ( 基于 LED) 的高內(nèi)涵成像系統(tǒng) (MolecularDevices) 上進(jìn)行。使用的濾光片如表 1 所示。

5.圖像分析采用 IN Carta 圖像分析軟件。所選擇的測(cè)量包括與強(qiáng)度、紋理、形狀、空間關(guān)系和共定位分?jǐn)?shù)相關(guān)的參數(shù)。

6.細(xì)胞水平的數(shù)據(jù)被上傳到 StratoMineR (https://cla.stratominer.com/index.php, Core Life Analytics)進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析。簡(jiǎn)要地說，采用了質(zhì)量控制、孔歸一化、數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和特征標(biāo)準(zhǔn)化。使用主成分分析(PCA) 對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行降維。進(jìn)一步的下游分析，如進(jìn)行基于主成分和表型距離得分的 hit 選擇和聚類分析。

結(jié)果

圖像采集

Cell Painting 實(shí)驗(yàn)使用六種熒光標(biāo)記同時(shí)標(biāo)記細(xì)胞，然后對(duì)各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像。高爾基體 ( AGP 通道 ) 和細(xì)胞骨架均使用相同的濾光片組成像 ( 表 1，圖 1 )。這些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的解析通常在圖像分析步驟中進(jìn)行。在我們的模型實(shí)驗(yàn)中，用 11 種化合物處理 U2OS 細(xì)胞 24 小時(shí)，然后再

根據(jù)之前發(fā)表的方法進(jìn)行。^1、2然后使用 5 個(gè)成像通道對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像 ( 圖 1 )。

為了從細(xì)胞骨架中分離出高爾基體結(jié)構(gòu)，我們修改了檢測(cè)方法，將 Alexa Fluor 568 Phalloidin 換成 Alexa Fluor 750Phalloidin，并使用配備了近紅外光源的 ImageXpressConfocal HT. ai 高內(nèi) 涵成像系統(tǒng) 對(duì) 細(xì) 胞進(jìn) 行成像 ( 圖2A ) ( 以下簡(jiǎn)稱改進(jìn)的檢測(cè) )。用這種方法，可以在未經(jīng)處理的細(xì)胞中清楚地看到高爾基體結(jié)構(gòu)在核周分布。當(dāng)WGA( 高爾基體 ) 和鬼筆環(huán)肽 ( 肌動(dòng)蛋白 ) 染色在同一通道成像時(shí)，這種分布不易區(qū)分 ( 圖 1 )。這種差異在化合物( 如粉防己堿 ) 處理的細(xì)胞中更為明顯 ( 圖 2B )。

圖 2 Cell Painting 實(shí)驗(yàn)改進(jìn)使用遠(yuǎn)紅外光源的改良方案，以改善 Cell Painting 實(shí)驗(yàn)中的光譜分離。 A)Phalloidin Alexa Fluor 750 用于在改良方案中標(biāo)記肌動(dòng)蛋白。顯示了來自對(duì)照孔的示例圖像。插圖 ( 白色框 ) 被放大，顯示為細(xì)胞核 ( 藍(lán)色 ) 和高爾基體通道 ( 黃色 ) 的合成圖。高爾基斑點(diǎn)明顯分布在核周組織中。B) 細(xì)胞用粉防己堿處理的圖像。左邊是肌動(dòng)蛋白和高爾基體通道疊加的重建圖像 ( 黃色 )。右邊顯示只有高爾基體 ( 黃色 ) 和細(xì)胞核 ( 藍(lán)色 ) 的圖像。改良方案中粉防己堿對(duì)高爾基體分布的影響更為明顯 ( 右 )。C) 激光光源及其相對(duì)功率顯示。標(biāo)示展示了各個(gè)光源檢測(cè)的細(xì)胞區(qū)域。

特征提取和數(shù)據(jù)分析

為了量化標(biāo)準(zhǔn) cell paint 染料組與改良染料組染色的細(xì)胞之間的差異，在 IN Carta 圖像分析軟件中分析圖像 ( 圖3 )。提取的測(cè)量數(shù)據(jù)上傳到 HC StratoMineR 進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析。從標(biāo)準(zhǔn) Cell Painting 實(shí)驗(yàn)與改良實(shí)驗(yàn)提取的數(shù)據(jù)執(zhí)行主成分分析 (PCA)。有趣的是，AGP 通道的測(cè)量構(gòu)成了 PCA 1 中 5 通道圖像的大部分特征成分。然而肌動(dòng)蛋白通道的測(cè)量構(gòu)成了 PCA 1 中改良后的 6 通道圖像的大部分主要特征 ( 圖 4 )。這表明，改進(jìn)的分析方法可以提高肌動(dòng)蛋白和高爾基體組分之間的表型圖譜的分辨率，這對(duì)了解 MOA 是有用的。

我們還根據(jù)距離評(píng)分比較了標(biāo)準(zhǔn)和改良 Cell Painting 實(shí)驗(yàn)之間的表型特征。該分?jǐn)?shù)表示一個(gè)樣本與陰性對(duì)照之間的表型距離，可用于篩選實(shí)驗(yàn)中的 hit 選擇。我們發(fā)現(xiàn)已知影響高爾基體通路的化合物的距離分?jǐn)?shù)有所增加( 表 2 )。這些結(jié)果表明，對(duì)高爾基體和細(xì)胞骨架使用單獨(dú)的成像通道增加了 Cell Painting 實(shí)驗(yàn)的敏感性，并更有力地代表了細(xì)胞表型特征。

圖 3 在 IN Carta 軟件中進(jìn)行特征提取，對(duì)各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行分割。在這里，內(nèi)置的細(xì)胞核模型被用來在所有處理中實(shí)現(xiàn)核的穩(wěn)定分割。對(duì)于 6 通道采集的圖像，每個(gè)細(xì)胞提取 487 個(gè)特征。這里展示的是在 IN Carta 軟件中帶有特征掩模疊加的示例圖像。

圖 4 使用 HC StratoMineR 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。A) HC StratoMineR 是一個(gè)基于網(wǎng)頁的平臺(tái)，引導(dǎo)用戶通過一個(gè)典型的工作流分析高內(nèi)涵的多參數(shù)數(shù)據(jù)。B) 用 PCA( 廣義加權(quán)最小二乘法 ) 將數(shù)據(jù)減少到 15 個(gè)成分。特征對(duì) PCA1 的貢獻(xiàn)顯示為一個(gè)極線圖。根據(jù)它們所代表的細(xì)胞區(qū)域，用特征顏色編碼。PCA1 特征從 5 通道 ( 上 ) 和 6 通道 ( 下 ) Cell Painting 采集。請(qǐng)注意特性的貢獻(xiàn)有所不同。

總結(jié)

•我們的結(jié)果表明，使用近紅外激光提高了 Cell Painting檢測(cè)的靈敏度。在這種情況下，它允許開發(fā)一種分離高爾基體表型更敏感的分析方法。

• 額外的通道還允許通過添加項(xiàng)目特定的生物標(biāo)記物來擴(kuò)展標(biāo)準(zhǔn)的 Cell Painting 分析。