如何在NextSeq™ 500/550和MiniSeq™平臺(tái)進(jìn)行低多樣性文庫(kù)測(cè)序
若希望低多樣性文庫(kù)在NextSeq™ 500/550和MiniSeq™平臺(tái)上獲得精確和穩(wěn)定的測(cè)序結(jié)果，需要精心設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)以及良好的生信分析。低多樣性文庫(kù)最常見(jiàn)的例子是基于擴(kuò)增方法制備的文庫(kù)，例如16S宏基因組文庫(kù)。這些文庫(kù)擴(kuò)增引物結(jié)合的位置，即起始位點(diǎn)的DNA序列基本是相同的。單一的位點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致堿基組成不平衡，以至于堿基組成從一個(gè)循環(huán)到下一個(gè)循環(huán)可能會(huì)發(fā)生劇烈變化。

NextSeq™ 500/550和MiniSeq™系統(tǒng)使用的是雙通道測(cè)序技術(shù)。因此，確保每個(gè)循環(huán)中均存在4種DNA堿基是非常重要的，這樣分析軟件才能正確鑒定DNA簇并精確讀取堿基序列。低多樣性文庫(kù)測(cè)序時(shí)，為了滿足這種要求，我們建議在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，采用以下幾種方法保證每個(gè)循環(huán)的多樣性。

利用標(biāo)簽區(qū)分技術(shù)，在測(cè)序中加入多個(gè)帶有標(biāo)簽的來(lái)自多種應(yīng)用的樣品, 關(guān)于NextSeq™ 500/550和MiniSeq™測(cè)序系統(tǒng)上Index混合的指導(dǎo)方針我們會(huì)在下面詳細(xì)介紹。

· 用多樣性較高應(yīng)用的帶有標(biāo)簽的樣品，例如全基因組測(cè)序文庫(kù)，來(lái)增加文庫(kù)堿基多樣性

· 為了獲得最佳測(cè)序結(jié)果，可以利用單標(biāo)簽或者雙標(biāo)簽技術(shù)，將多個(gè)樣品在同一張F(tuán)low Cell上進(jìn)行測(cè)序

在測(cè)序時(shí)摻入全基因組樣品（例如PhiX）

· 可以加入50% PhiX為初始摻入比例，然后根據(jù)一級(jí)分析和二級(jí)分析的結(jié)果，逐步降低PhiX摻入比例。摻入這樣的樣品能提供每個(gè)循環(huán)必需的堿基多樣性。

在NextSeq™ 500/550和MiniSeq™平臺(tái)原始簇密度最佳范圍如下所示, 而低多樣性文庫(kù)在此基礎(chǔ)上須視情況降低上樣量以提升測(cè)序質(zhì)量：

· MiniSeq™試劑原始簇密度最佳范圍為170-220 K/mm2

· NextSeq™ 500/550試劑原始簇密度最佳范圍為170-220 K/mm2

NextSeq™ 500/550和MiniSeq™測(cè)序系統(tǒng)Index混合的指導(dǎo)方針

在NextSeq™ 500/550 和MiniSeq™測(cè)序系統(tǒng)上對(duì)混合文庫(kù)進(jìn)行Index測(cè)序時(shí)，非常重要的一點(diǎn)是要選擇合適的Index組合，否則可能會(huì)因?yàn)樽xIndex時(shí)簇定位失敗而導(dǎo)致Index測(cè)序失敗。

NextSeq™ 500/550和MiniSeq™為雙通道測(cè)序
NextSeq™ 500/550和MiniSeq™測(cè)序系統(tǒng)只需要2張圖片就可以區(qū)分4種堿基：一張圖片來(lái)自紅光通道，另一張圖片來(lái)自綠光通道。不同于每種堿基各帶一種單獨(dú)的熒光標(biāo)記的四通道測(cè)序，雙通道測(cè)序使用兩種熒光染料，C堿基標(biāo)記紅色，T堿基標(biāo)記綠色，A堿基同時(shí)標(biāo)記紅色和綠色，G堿基沒(méi)有熒光標(biāo)記。
 

 

圖1：雙通道SBS熒光成像（假彩色圖片僅是效果圖）為了提高4種DNA堿基的檢測(cè)速度，MiniSeq™和NextSeq™ 500/550只用了2個(gè)圖像分別捕捉紅色和綠色波段的信號(hào)。僅在紅色或綠色圖像檢測(cè)到的cluster分別被轉(zhuǎn)譯為C和T堿基。同時(shí)在紅色圖像和綠色圖像被檢測(cè)到的cluster被轉(zhuǎn)譯為A堿基，在兩張圖片中都沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào)的cluster將被認(rèn)為是G堿基。

NextSeq™500/550和MiniSeq™相關(guān)Index的考量

Index reads中前兩個(gè)循環(huán)必須至少有一個(gè)堿基不是G。如果Index read前面兩個(gè)堿基都是G，就會(huì)由于沒(méi)有熒光信號(hào)導(dǎo)致cluster定位失敗，所以Index的前兩個(gè)循環(huán)中必須有一個(gè)堿基有信號(hào)才能確保Index的正常拆分。

選擇Index進(jìn)行組合時(shí)，每個(gè)循環(huán)都至少有一個(gè)通道有信號(hào)，最好是兩個(gè)通道都有信號(hào)。這樣堿基讀取的過(guò)程才能確保數(shù)據(jù)分析的精確。

· 紅色通道對(duì)應(yīng)A或者C堿基

· 綠色通道對(duì)應(yīng)A或者T堿基

Index組合的示例

理想的Index組合：每個(gè)循環(huán)需要兩個(gè)通道都有信號(hào)

可接受的Index組合：只有一個(gè)通道有信號(hào)，但是仍然有足夠的信號(hào)進(jìn)行測(cè)序

不好的Index組合：Index read前兩個(gè)堿基都是G，沒(méi)有信號(hào)產(chǎn)生，導(dǎo)致cluster定位失敗。

上述中的這些建議能夠使得NextSeq™ 500/550和MiniSeq™平臺(tái)進(jìn)行低多樣性文庫(kù)測(cè)序。