高通量蛋白質(zhì)組分析
速度“更快”！鑒定數(shù)量“更高”！

靈敏度（尤其是MS/MS靈敏度）是蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵性能指標(biāo)，高靈敏度的MS/MS為蛋白質(zhì)鑒定（ID）提供了廣泛而深入的覆蓋。ZenoTOF 7600系統(tǒng)使用Zeno trap技術(shù)，在整個(gè)碎片離子質(zhì)量范圍內(nèi)增加占空比≥90%，在MS/MS模式下獲得4-25倍的增益3，這些提升可以在蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)研究中提供出色的表現(xiàn)。

在分別激活和不激活Zeno 阱的情況下，上樣400 ng K562細(xì)胞裂解液進(jìn)行10分鐘液相梯度的MS/MS信號(hào)采集。粉色曲線為開啟Zeno阱的MS/MS總離子色譜圖，藍(lán)色曲線為關(guān)閉Zeno阱的MS/MS總離子色譜圖（圖1）。當(dāng)使用Zeno阱時(shí)，TIC高度顯著增加。此外，MS/MS的譜圖質(zhì)量也大大提高。
 

圖1.  在Zeno 阱激活和未激活時(shí)400 ng K562 細(xì)胞裂解液在10 min液相梯度中采集的數(shù)據(jù)對(duì)比。
 

通量也是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中非常重要的因素，ZenoTOF 7600系統(tǒng)配備微升流速液相體系，在短梯度內(nèi)也能達(dá)到較高的肽段鑒定數(shù)量，并且開啟Zeno阱的功能有助于提高肽段鑒定。在上樣200 ng K562細(xì)胞裂解液時(shí)，對(duì)比Zeno 阱開關(guān)時(shí)肽段鑒定數(shù)量，可以看到，在所有梯度內(nèi)，Zeno阱的激活都有助于鑒定數(shù)量的提升，在20 min以上的有效梯度中，Zeno阱的激活可以使肽段鑒定數(shù)量增加超過55%（圖2）。
 

圖2. 激活Zeno阱后肽段鑒定數(shù)量增加。在global FDR 為1%時(shí)，200 ng K562細(xì)胞裂解液在不同梯度中的肽段鑒定數(shù)量。Zeno阱大大增加了所有梯度中的肽段鑒定數(shù)量。
  

Zeno阱的應(yīng)用對(duì)于蛋白質(zhì)和肽段數(shù)量的鑒定都有很大程度的提高，通過對(duì)比ZenoTOF 7600系統(tǒng)與TripleTOF™ 6600系統(tǒng)，無論在短梯度和長梯度中，相同進(jìn)樣量時(shí)7600系統(tǒng)鑒定到的蛋白數(shù)量和肽段數(shù)量都超過6600系統(tǒng)。

圖3. 在10min （左側(cè)）和45min （右側(cè)）梯度中ZenoTOF 7600系統(tǒng)與TripleTOF 6600系統(tǒng)鑒定到肽段和蛋白質(zhì)數(shù)量對(duì)比。與TripleTOF 6600系統(tǒng)（紅色）相比，ZenoTOF 7600系統(tǒng)（藍(lán)色）鑒定出更多的肽段和蛋白質(zhì)。
 

大規(guī)模蛋白質(zhì)和多肽定量分析
靈敏度“更高”！速度“更快”！

 

ZenoTOF 7600系統(tǒng)具有較高的分辨率、更高的選擇性、TOF MS/MS數(shù)據(jù)的靈活性，還可提供出色的多維度定量性能。使用Zeno MS/MS，質(zhì)荷比300以上的肽段離子的理論靈敏度提高了4-6倍3。采用Zeno trap關(guān)閉與Zeno trap打開的最終測(cè)定方法對(duì)804個(gè)肽段進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)，并評(píng)價(jià)了MS/MS靈敏度（圖4）。所監(jiān)測(cè)肽段的靈敏度符合預(yù)期，平均峰面積提高約5倍。
 

圖4. 激活Zeno trap后多肽峰面積顯著增加。（上圖）顯示了ANT3.PFLVFIR 激活Zeno trap時(shí)觀察到的靈敏度提高的示例數(shù)據(jù)，峰面積提高約6 倍。（下圖）匯總展示了所有 804 種肽檢測(cè)到的靈敏度數(shù)據(jù)，通過前體離子m/z提取數(shù)據(jù)，平均提高為 5.6倍。
 

為了使用僅20分鐘的快速梯度執(zhí)行如此高度多重的分析，必須具有高度可重現(xiàn)的色譜和良好的峰形，以便可以使用非常窄的預(yù)定時(shí)間窗口（圖5）。在捕集-洗脫模式下，整個(gè)梯度的保留時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)偏差大多小于2秒。建立了最終的 804 種肽Scheduled MRMHR檢測(cè)方法后，同時(shí)評(píng)估了肽段定量的重現(xiàn)性。10 次重復(fù)進(jìn)樣中，804 種肽段在加入酶解的人血漿基質(zhì)后的每種肽的中值%CV為 6.1%，表明這種 804 種重標(biāo)肽的高度多重分析具有極高的重現(xiàn)性，97.9% 的多肽的 %CV 小于 20% （圖6）。
 

圖5. 10 次血漿樣品重復(fù)的色譜峰重現(xiàn)性。（上圖）在整個(gè)方法開發(fā)和最終數(shù)據(jù)生成過程中都檢測(cè)到了非常好的色譜重現(xiàn)性，804 種肽段和所有 10次重復(fù)的平均%RSD 為 0.23。（下圖）運(yùn)行中檢測(cè)到的保留時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)偏差與檢測(cè)到的保留時(shí)間圖，顯示大多數(shù)峰在 10 次重復(fù)中的偏移小于幾秒。

 

翻譯后修飾（PTM）在多種生物學(xué)過程中扮演重要角色，包括蛋白質(zhì)構(gòu)象和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等等。賴氨酸酰化，例如丙二�；�，是一種部分受Sirtuin（SIRT）蛋白質(zhì)家族的成員賴氨酸脫酰酶調(diào)節(jié)的PTM。在之前一項(xiàng)關(guān)于SIRT5調(diào)節(jié)的賴氨酸丙二酰組的研究中發(fā)現(xiàn)，在1137個(gè)丙二酰賴氨酸鑒定位點(diǎn)（來自430個(gè)蛋白質(zhì)）中，183個(gè)位點(diǎn)（來自120個(gè)蛋白質(zhì)）在SIRT5 - / - KO 小鼠中比野生型小鼠中顯著增加1。具體來說，丙二�；�可調(diào)節(jié)GAPDH的活性，因此丙二�；�的鑒定對(duì)于研究代謝相關(guān)通路具有重要意義。然而，丙二�；�肽段通常很難通過質(zhì)譜和CID來表征，因?yàn)檫@種修飾極其不穩(wěn)定。

ZenoTOF 7600系統(tǒng)具備靈活的多重碎裂能力：碰撞誘導(dǎo)解離（CID）和電子活性解離（EAD），通過觀察來自GAPDH（TVDGPSGKmaLWR，K-192）中的丙酰基位點(diǎn)在兩種正交的碎裂模式（EAD與CID）中的碎片，可以看到使用CID碎裂模式，y離子系列碎片中活性丙二�；鶊F(tuán)中CO2顯著的中性丟失(-44 m/z)（圖8A），然而EAD碎裂模式可生成完整的z+1離子和c離子系列碎片，在MS/MS圖譜中很容易檢測(cè)到（圖8B）2。具體來說，從z4+1到z11+1，或者包含不穩(wěn)定PTM的c9和c10等碎片離子，都沒有發(fā)生顯著的中性丟失，這使得PTM位點(diǎn)得以明確定位。

 

圖8. TVDGPSGKmaLWR肽段在CID和EAD模式下的MS/MS譜圖。丙二�；�肽段 （m/z656.3320） 分別采用(A) CID模式和(B) EAD模式(KE=5 eV)進(jìn)行分析。CID碎裂會(huì)導(dǎo)致-CO2(-44)的中性丟失，無法檢測(cè)到“完整的”PTM特異性區(qū)分性離子。全面的EAD解離產(chǎn)生了高強(qiáng)度的碎片離子，為直接的PTM位點(diǎn)定位提供了證據(jù)。
 

利用ZenoTOF 7600系統(tǒng)上 EAD 的動(dòng)能（KE）可調(diào)節(jié)特性，可確定保留PTM修飾肽段上不穩(wěn)定修飾的適合解離參數(shù)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)更佳的靈敏度。KE值為5 eV時(shí)，可產(chǎn)生高強(qiáng)度、完整的 PTM 位點(diǎn)特異性碎片離子，同時(shí)背景噪聲很小。當(dāng)KE增加到8 eV或更高時(shí)，MS/MS譜圖變得更加復(fù)雜，含有PTM修飾的碎片離子的中性丟失出現(xiàn)（圖9）。

圖9.  EAD動(dòng)能 （KE） 值對(duì)碎裂模式的影響。 在EAD模式下分析丙二�；�肽段TVDGPSGKMALWR （m/z 656.330） 的MS / MS圖譜，其動(dòng)能值分別為（A） 5 eV和（B） 8 eV。
 

7600系統(tǒng)中Zeno阱的應(yīng)用大幅度提升了MS/MS圖譜質(zhì)量和靈敏度。在激活Zeno阱和未激活Zeno阱的情況下分別采集的EAD MS/MS圖譜顯示，Zeno阱可提供明顯的靈敏度增益（圖10）。

圖10. Zeno阱激活時(shí)靈敏度提升。TVDGPSGKmaLWR肽段 （m/z 656.3320） 采用EAD模式(KE=5 eV)在(A)未激活和(B)激活Zeno阱時(shí)的MS/MS譜圖。當(dāng)與EAD結(jié)合使用Zeno阱時(shí)，可觀察到信號(hào)強(qiáng)度和圖譜質(zhì)量的顯著改善，使PTM定位更明確。
 

同樣，ZenoTOF 7600系統(tǒng)對(duì)于蛋白質(zhì)磷酸化的分析中也提供了更多有利的信息，對(duì)磷酸化位點(diǎn)的定位和定量都很有幫助。CID對(duì)磷酸化肽段進(jìn)行PTM位點(diǎn)定位及定量時(shí)，小的y離子和大的b離子往往難以檢測(cè)，此外，CID MS/MS會(huì)誘導(dǎo)一些不穩(wěn)定磷酸化肽段上的H3PO4 （-98 m/z）的中性丟失（圖4B, D）。幸運(yùn)的是，使用EAD分析能夠檢測(cè)到含有PTM的位點(diǎn)特異性離子，并且具有很好的信號(hào)強(qiáng)度，為每個(gè)肽段上的磷酸化位點(diǎn)提供了直接的證據(jù)（圖11A, C），對(duì)于一個(gè)序列中包含多個(gè)磷酸化位點(diǎn)的肽段，可以做到精確定位。
 

圖11.  EAD解離使不穩(wěn)定的磷酸基團(tuán)得以保存。在Skyline中提取 （A, B） LITVDGNICpSGKSK和 （C, D）  LITVDGNICSGKpSK在 （A, C）  EAD模式 (KE=2)和 （B, D） CID模式下分析的磷酸化異構(gòu)體。在EAD模式下，不穩(wěn)定的磷酸基團(tuán)被保留。
 

參考文獻(xiàn)：

1.Nishida Y, Rardin MJ et al. (2015) SIRT5 regulates both cytosolic and mitochondrial protein malonylation with glycolysis as a major target. Mol Cell, 59:321-32.

2.PTM site localization and isomer differentiation of phosphorylated peptides – Tunable electron activated dissociation (EAD) MS/MS using the ZenoTOF 7600 system. SCIEX technical notr RUO-MKT-02-13174-A.

3.Qualitative flexibility combined with quantitative power. SCIEX technical note, RUO-MKT-02-13053-A.