P21 活化蛋白激酶(p21-activated protein kinase, PAK)作為一類保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是 Rho 家族中的小 GTP 酶 CDC42 及 Rac1的效應(yīng)蛋白,介導(dǎo)其下游信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。 PAK4 是 PAKs 中的一員,當(dāng) PAK4 表達異常時,細胞發(fā)生癌變。Wang C 等研究表明[1],PAK4 在肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、胰腺癌和乳腺癌細胞中的表達含量遠遠高于正常細胞,對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和遷移產(chǎn)生重要影響。因此,PAK4 抑制劑的開發(fā)是多種腫瘤治療行之有效的策略之一。
Hao C 等[2], 基于藥物的結(jié)構(gòu),設(shè)計并合成了一系列氨基喹唑啉類 PAK4 抑制劑,同時對該系列化合物進行選擇性和藥代動力學(xué)性質(zhì)優(yōu)化,獲得了一個高活性高選擇性的 PAK4 抑制劑 31(CZh226)。它對 PAK4 的 Ki 值為 9 nM,對多種激酶表現(xiàn)出優(yōu)秀的選擇性,其中對 PAK1 的 Ki 值為 3112 nM,選擇性差異達到了 346 倍。多種優(yōu)秀的藥效和藥代動力學(xué)參數(shù)使得化合物 31 被選做先導(dǎo)化合物,進一步進行抗癌藥物的開發(fā)。(圖1)
圖1. 化合物 31 的結(jié)構(gòu)式(圖片來源:《J. Med. Chem.》)
研究者隨后探究了 PAK4 與化合物 31 的作用模式,共晶復(fù)合物結(jié)構(gòu)顯示,化合物 31 的氨基吡唑與 Glu396 和 Leu398 形成氫鍵并相互作用,環(huán)丙基與 Met395 和Val335 形成了很強的疏水相互作用,哌嗪環(huán)上的 NH 與 Asp458 的羧基形成氫鍵作用,Asp444 的羧基通過誘導(dǎo)分子的構(gòu)象變化進而與哌嗪環(huán)上的 NH 形成靜電作用。而化合物 31 與 PKA1 的預(yù)測結(jié)合模式顯示,氨基酸殘基 Asp407 側(cè)鏈發(fā)生位移,從而難以與哌嗪環(huán)上的 NH 形成靜電作用。此外,化合物 31與 PKA4 對接打分優(yōu)于其與 PKA1 的對接打分,這些結(jié)果與體外選擇性實驗結(jié)果一致。(圖2)
圖2. (A,C)PAK4 與化合物 31 的共晶結(jié)構(gòu)(PDB:5XVG);
(B,D)PAK1與化合物31的預(yù)測結(jié)合模式(圖片來源:《J. Med. Chem.》)
激酶譜實驗顯示,化合物 31 在 0.1 μM 和 1.0 μM 濃度下對多種激酶具有很好的選擇性。其中,在 0.1 μM 的篩選濃度下對 PAK4 產(chǎn)生超過80%的抑制(PAK4 IC50=0.0111 μM),這可能是由于化合物 31 與 PKA4 蛋白的 DFG 模塊在空間上可以更好的結(jié)合。(圖3)
圖3. 化合物 31 在 0.1 μM 和1.0 μM 下對 54 個激酶的選擇性(圖片來源:《J. Med. Chem.》
通過細胞實驗進一步評價化合物 31 對 PAK4 的抑制作用。首先采用非小細胞肺癌細胞株 A549 來評價化合物的抗增殖作用。其次,采用 HEK-293 細胞(人類胚胎腎 293 細胞)和生長不依賴于 PAK4 的 NCI-H460 細胞株(人類大細胞肺癌細胞)來評價化合物的潛在脫靶效應(yīng)。結(jié)果顯示,化合物 31 對 A549 細胞(圖 4A)具有中度的抗增殖活性,這一相對較低的細胞生長抑制活性結(jié)果表明,PAK4 可能不是這些癌細胞增殖的“驅(qū)動力”。隨后使用劃痕法和 Transwell 法評估化合物 31 對腫瘤細胞遷移和侵襲的影響,未給藥的 A549 細胞在劃痕后的 2天內(nèi),大部分的劃痕部位都被填滿了,而給予一定劑量的化合物 31 后則顯著抑制了傷口愈合(圖 4B)。這一結(jié)果表明化合物 31 可顯著抑制 A549 細胞遷移和侵襲(圖 4C)。與此相反,NCI-H460 和 HEK-293 細胞遷移和侵襲的減少并不明顯,這表明化合物 31 對細胞活性的抑制是通過抑制 PAK4 而產(chǎn)生的。(圖 4)
圖4. 化合物 31 通過抑制 PAK4 激酶活性調(diào)節(jié)下游信號通路來抑制 A549 的遷移和入侵
(圖片來源:《J. Med. Chem.》)
小M 的小思考:
PAK4 作為一種有潛力的藥物開發(fā)靶點,其抑制劑的開發(fā)為治療相關(guān)的癌癥提供了新思路。截至目前,PAK4 的抑制劑數(shù)量很少,且多數(shù)抑制劑的活性不理想。目前已經(jīng)進入臨床階段的小分子抑制劑有 KPT-9274 和 PF-3758309,其具有良好的 PAK4 抑制效果和藥代動力學(xué)性質(zhì)。本文發(fā)現(xiàn)了一個新型、強效高選擇性的 PAK4 抑制劑 31(CZh226),它通過抑制 PAK4 激酶活性,調(diào)節(jié) PAK4 的下游信號通路,抑制了A549 腫瘤細胞的遷移和入侵,是一個有潛力的先導(dǎo)化合物,可用于進一步抗癌藥物的開發(fā)。
Reference:
[1] Wang C, et al. Oncogenic PAK4 regulatesSmad2/3 axis involving gastric tumorigenesis. Oncogene.2014 Jun 26;33(26):3473-84.
[2] Hao C,et al. Structure-Based Design of 6-Chloro-4-aminoquinazoline-2-carboxamideDerivatives as Potent and Selective p21-Activated Kinase 4 (PAK4) Inhibitors. J.Med. Chem., 2018, 61 (1), 265–285.
相關(guān)產(chǎn)品:
KPT-9274 是有口服活性的 PAK4 /煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶 (Nampt) 抑制劑,IC50 值分別為小于 100 和 125 nM。
FRAX1036 是一種 PAK抑制劑,對 PAK1,PAK2 和 PAK4 的 Ki 值分別為 23.3 nM,72.4 nM 和 2.4 μM。
PF-3758309 是一種有效的 PAK 抑制劑,能夠抑制 PAK4 的活性,IC50 值為1.3 nM。