受體相互作用蛋白1（RIP1）激酶屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。其 C 端含死亡結(jié)構(gòu)域，通過自身相互結(jié)合或與其它含死亡結(jié)構(gòu)域的分子（如 TRADD、Fas、TNFRI）結(jié)合，參與 TNF、FasL 刺激后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，介導(dǎo) NF-κB 活化，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其功能受泛素化、鋅指蛋白及熱休克蛋白等的調(diào)節(jié)。研究表明^[1,2]，RIP1 激酶的活化與缺血性損傷、炎癥性疾病、神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)。Yoshikawa 等^[3]，以 RIP1 為靶點(diǎn)，設(shè)計(jì) RIP1 激酶抑制劑用于治療自身免疫性腦脊髓炎等神經(jīng)退行性疾病。

Yoshikawa 等，首先構(gòu)建了 TR-FRET 體外篩選平臺(tái)，然后運(yùn)用該方法對(duì)課題組已有的化合物庫進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)了苯并咪唑衍生物 10，其 pKi 值為 7.20。隨后將其與已報(bào)道的 RIP1 抑制劑 6 進(jìn)行分子融合，設(shè)計(jì)了化合物 11，其擁有全新的母核結(jié)構(gòu)和中等活性的 RIP1 抑制活性。研究表明，化合物 6 可以被 p 糖蛋白外排，進(jìn)而導(dǎo)致較差的血腦屏障通透性。但是，化合物 11 卻擁有較低的p 糖蛋白外排率，這也許是因?yàn)槠錁O性表面積減小，氫鍵供體數(shù)量減少的原因。隨后以 11 為先導(dǎo)化合物對(duì)母核進(jìn)行替換，期望能夠在保持其優(yōu)異理化性質(zhì)的同時(shí)，提高化合物的活性（圖1）。經(jīng)過一系列的結(jié)構(gòu)改造，結(jié)果如圖 2 所示，化合物 14 擁有最強(qiáng)的活性（pKi＝8.41）和 較低的 p 糖蛋白外排率（ER=0.7）。

圖 1. 化合物 6、10 和 11 的結(jié)構(gòu)式（圖片來源：《J.Med. Chem.》）

圖2. 化合物母核的改造（圖片來源：《J.Med. Chem.》）

為了更好的研究化合物 14 與靶蛋白的作用模式，研究人員進(jìn)行了分子對(duì)接，結(jié)果如圖 3 所示。根據(jù)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造：1）分子中的芐基伸入疏水變構(gòu)調(diào)節(jié)口袋，該口袋位于 ATP 結(jié)合口袋的背面，主要由親脂性氨基酸殘基 Leu129 和 Val134 的側(cè)鏈組成，因此可以在苯環(huán)上引入合適的取代基來探討活性的變化，也可以在苯環(huán)上增加與 Ser161 的氫鍵相互作用（R1）；2）吡唑環(huán)的 3 位周圍存在一個(gè)較小的疏水口袋，在該處引入取代基來探討口袋的大�。≧2）；3）通過在化合物左側(cè)苯環(huán)的間位和對(duì)位引入取代基（R3）改善化合物的 ADMET 性質(zhì)。經(jīng)過一系列的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，作者得到了候選化合物 22，其 pKi 值為 9.04，ER 值為 0.6，在人和小鼠肝微粒體中的清除率均小于 1 μL/min/mg，小鼠口服生物利用度為 52.2%。晶體結(jié)構(gòu)復(fù)合物也闡明了其與靶蛋白的確切作用模式。（圖4）

圖 3.（A－B）化合物 14 與 RIP1 蛋白的分子對(duì)接圖；（C）化合物的設(shè)計(jì)及化合物 22 的分子結(jié)構(gòu)式（圖片來源：《J.Med. Chem.》）

圖 4.化合物 22 與 RIP1 蛋白的共晶復(fù)合物（圖片來源：《J. Med. Chem.》）

      鑒于化合物 22 優(yōu)異的體外活性和藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，隨后進(jìn)行體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)�？诜�給藥 26 天，每天監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎模型（EAE）小鼠的臨床癥狀�？瞻讓�(duì)照組小鼠在第 12 天開始出現(xiàn) EAE 臨床癥狀，并在 21 天左右達(dá)到頂峰；與之對(duì)應(yīng)的給藥組可以減弱 EAE 臨床癥狀。這一結(jié)果表明，化合物 22 可以預(yù)防 EAE 模型的疾病進(jìn)展。（圖5）

圖 5. 評(píng)價(jià)化合物 22 在 EAE 模型中的效果

小M 的小思考：

RIP1 作為細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，自從其被發(fā)現(xiàn)以來就備受關(guān)注。其不僅參與促細(xì)胞存活的信號(hào)傳導(dǎo)，還參與多種途徑的細(xì)胞程序性死亡信號(hào)傳導(dǎo)，與多種疾病如癌癥、神經(jīng)退行性疾病、自身免疫性疾病密切相關(guān)。該靶點(diǎn)的抑制劑 GSK2982772 目前正在進(jìn)行炎癥性疾病的臨床研究，如潰瘍性結(jié)腸炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病等。然而，針對(duì)神經(jīng)退行性疾病尚未有抑制劑進(jìn)入臨床研究，其原因主要是因?yàn)橐种苿┹^低的口服生物利用度和較差的腦通透性。本研究通過高通量篩選和基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)，發(fā)現(xiàn)了活性高、藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)優(yōu)、p 糖蛋白外排率低的新穎候選化合物 22。該化合物在實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎模型（EAE）小鼠上表現(xiàn)出明顯的療效，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

Reference：

[1] Wegner, K. W.; et al. Complex pathologic roles of RIPK1 and RIPK3: movingbeyond necroptosis. Trends Pharmacol.Sci. 2017, 38, 202−225.

[2] Shao, L.; et al. The contribution of necroptosis in neurodegenerative diseases.Neurochem. Res. 2017, 42, 2117−2126.

[3] Yoshikawa, M.; et al. Discovery of 7‐Oxo-2,4,5,7-tetrahydro‐6Hpyrazolo[3,4‐c]pyridineDerivatives as Potent, Orally Available, and Brain Penetrating ReceptorInteracting Protein 1 (RIP1) Kinase Inhibitors: Analysis of Structure−KineticRelationships. J. Med. Chem. 2018, 61,2384−2409.

相關(guān)產(chǎn)品：

GSK2982772

GSK2982772 是有效，ATP 競(jìng)爭(zhēng)型的 RIP1 抑制劑，IC₅₀ 值為16 nM。

Necrostatin-1

Necrostatin-1 是 RIP1 激酶抑制劑，作用于 Jurkat 細(xì)胞，抑制程序性壞死，EC₅₀ 為490 nM。

GSK'481

GSK'481 能夠在 HEK293T 細(xì)胞中抑制 RIP1 WTS166 的磷酸化。