目前 EGFR 抑制劑共有四代，其中第一代的代表性抑制劑為吉非替尼和厄洛替尼，第二代的代表性抑制劑為阿法替尼，第三代的代表性抑制劑為 AZD9291 和   CO1686（5），第四代代表性抑制劑為 EAI045 。由于第一代抑制劑出現的耐藥性問題,使得以后的抑制劑都在針對耐藥基因突變來設計抑制劑結構。主要的耐藥突變有 L858R/T790M 雙突變和 C797S 。Hao Y 等^[2], 針對 EGFR T790M 突變設計了第三代 EGFR 抑制劑。作者將已報道的化合物 5 和化合物 7 進行分子融合和骨架躍遷，獲得一系列新骨架類型的 EGFR 三代抑制劑，其中化合物 20g 各方面藥理數據最優(yōu)，其對野生型 EGFR 蛋白的選擇性為 263 倍，在細胞中的選擇性為 35.5 倍。體內抗腫瘤實驗表明，H1975 細胞移植瘤小鼠的腫瘤抑制率為 73.2%，在 A431 細胞移植瘤小鼠的腫瘤抑制率為 37.2%。（圖1）

圖1 化合物 20g 的設計（圖片來源：《J. Med. Chem.》）

化合物 5（CO1686）和化合物 7 是已報道的針對 EGFR^L858R/T790M 雙突變的三代抑制劑。作者將兩個分子與 EGFR 蛋白的結合模式進行疊合，發(fā)現它們存在著很多相似的結合模式：1）氨基嘧啶部分可以與蛋白鉸鏈區(qū)的 Met793形成兩個氫鍵作用；2）左側的親水尾部伸向溶劑區(qū)；3）右側的丙烯酰胺部分與蛋白的 Cys797 形成共價鍵。此外，由于 EGFR 發(fā)生 T790M 突變，誘導蛋白中出現兩個口袋（S1 和 S2），其中化合物 5 的三氟甲基占據 S1 口袋，化合物 7 的N-甲基占據 S1 口袋。作者設想通過分子融合和骨架躍遷的策略設計化合物 14a，使其能夠同時占據 S1 和 S2 口袋，進一步提高活性和選擇性。分子對接結果顯示，化合物 14a 在保留了以上相互作用的基礎上，R3 位置的甲基可以伸向 S2 口袋，這與他們的設計初衷相符合。（圖2）體外酶活性結果顯示，化合物 14a 對 EGFR^L858R/T790M 和 EGFR^WT 的酶活性分別為 46 nM 和180 nM ,選擇性僅為 4 倍。細胞實驗表明，化合物對 H19751 細胞株（表達EGFR-L858R/T790M ）和 A431 細胞株（過表達 EGFR^WT）均活性較弱，IC₅₀ 大于 10 μM。隨后作者通過在 R3 位置引入取代基來改善化合物的細胞透膜性，以及對伸向溶劑區(qū)的部分進行改造，最終獲得了選擇性高活性好的化合物 20g，其對 EGFR^L858R/T790M 和 EGFR^WT 的酶活性分別為 0.3 nM 和 79 nM，選擇性高達 263 倍。 

圖2.（A）化合物 5 和 7 的結構；（B）化合物 5 和 7 與 EGFR 蛋白結合的分子疊合圖；（C）化合物 14a 與 EGFR 蛋白的分子對接圖；（D）新骨架化合物與靶蛋白的 2D 模式圖。（圖片來源：《J. Med. Chem.》）

Western Blot 實驗進一步評價化合物 20g 對 EGFR 信號通路的影響，結果如圖3所示，化合物 20g 在 1 nM 濃度下可以抑制 H1975 細胞（表達 EGFR-L858R/T790M ）中 EGFR 蛋白的磷酸化以及下游 AKT 蛋白的磷酸化。而在 A431 細胞株（過表達 EGFRWT）中，只有濃度達到 100 nM 時才對EGFR 和 AKT 的磷酸化產生抑制。這一結果表明，化合物 20g 在細胞水平具有很好的選擇性，并且靶向 EGFRL858R/T790M。

圖3. Western Blot 實驗（圖片來源：《J. Med. Chem.》）

體內藥效實驗表明， 50 mg/kg 口服給藥 14天后，化合物 20g 可以顯著抑制 H19751 移植瘤小鼠的腫瘤生長，腫瘤抑制率達到 73%，實驗前后小鼠體重沒有顯著影響，證明化合物沒有明顯的毒性。而對于 A431 移植瘤小鼠模型，50 mg/kg 口服給藥 14 天后，化合物 20g 對小鼠腫瘤的抑制率較低。（圖4）

圖4. 化合物 20g的體內抗腫瘤實驗。（圖片來源：《J. Med. Chem.》）

小M 的小思考：

隨著精準醫(yī)療時代的到來，其相比傳統診療手段具有更高的精準性。人們通過基因測序尋找個體化癌癥突變基因，從而迅速確定對癥藥物。這不僅節(jié)約尋找治療方法的時間，還可以提升治療效果。 EGFR 突變具有其獨特的患病人群，針對這一人群發(fā)展靶向 EGFR 突變的藥物可以更有效的治療非小細胞肺癌患者。Hao Y 等通過分子融合和骨架躍遷的方法獲得高選擇性和高活性的三代EGFR 抑制劑（20g），為治療非小細胞肺癌患者提供了新的化學實體分子。

參考文獻

[1] Hamaguchi R,etal. Effects of anAlkaline Diet on EGFR-TKI Therapy in EGFR Mutation-positive NSCLC. Anticancer Res. 2017Sep;37(9):5141-5145.

[2] Hao Y, et al.Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Pyrimido[4,5- d]pyrimidine-2,4(1 H,3 H)-diones as Potent and SelectiveEpidermal Growth Factor Receptor (EGFR) Inhibitors against L858R/T790M Resistance Mutation. JMed Chem. 2018

相關產品

AZD-9291 (Osimertinib;Mereletinib)

AZD-9291 是不可逆的突變體選擇性 EGFR 抑制劑；對 EGFR^L858R 和EGFR^L858R/T790M 的 IC₅₀ 值分別為 12 和 1 nM。

Gefitinib

Gefitinib 是一種有效的表皮生長因子受體 (EGFR) 抑制劑，在 NR6wtEGFR 細胞中，IC₅₀ 值為 2-37 nM。

CO-1686

CO-1686 是一種可口服的 EGFR 抑制劑，能夠抑制 EGFRL858R/T790M 和 EGFRWT 的活性，IC₅₀ 值分別為 21.5 nM 和 303.3 nM。

EAI045 

EAI045 是突變體 EGFR 變構抑制劑，在 10 μM ATP 時抑制 EGFR，EGFR^L858R，EGFR^T790M 和 EGFR^L858R/T790M 的 IC₅₀ 值分別為 1.9，0.019，0.19 和 0.002 μM。