牛IgG具有高達(dá)70個(gè)氨基酸的超長(zhǎng)CDR-H3結(jié)構(gòu)域。之前發(fā)現(xiàn)，具有牛的CDR-H3的HIV中和抗體會(huì)識(shí)別gp120 CD4結(jié)合位點(diǎn)上的表位，該表位通常凹陷于常規(guī)抗體。所以超長(zhǎng)CDR-H3抗體可能會(huì)識(shí)別一些人抗體無法識(shí)別的隱蔽表位，并擴(kuò)大抗體識(shí)別的靶點(diǎn)區(qū)域^[1]。

應(yīng)用案例
德國(guó)默克（Merck）的科學(xué)家們?cè)O(shè)計(jì)了基于牛CDR-H3雙特異性抗體，靶向腫瘤細(xì)胞上的表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）以及自然殺傷（NK）細(xì)胞上的天然細(xì)胞毒性受體NKp30。基于牛IgG的雙特異性抗體（BsAbs）引發(fā)了有效的NK細(xì)胞重定向，從而引發(fā)了EGFR過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞裂解以及促炎細(xì)胞因子的強(qiáng)勁釋放^[2]。
  牛源CDR-H3雙特異性抗體的產(chǎn)生示意圖。通過牛抗體文庫(kù)篩選出針對(duì)兩個(gè)靶標(biāo)（以紅色和黃色顯示）的識(shí)別序列。嫁接到人源Fab支架上，利用重鏈異源二聚技術(shù)（例如SEED技術(shù)）組裝成雙特異性抗體。
     Octet®高通量篩選高親和力雙特異性抗體

Octet®基于生物層干涉技術(shù)（BLI），是被美國(guó)藥典認(rèn)可的用于親和力檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法。Octet®具有高通量和易使用等特點(diǎn)，成為生物醫(yī)藥企業(yè)必備工具之一。在Merck的這個(gè)方案中，Octet®被選擇作為抗體親和力檢測(cè)的主要方法。
  Octet® Red 96，用Anti-human Fc傳感器固化抗體，分別與EGFR（左圖），NKp30（中圖）進(jìn)行結(jié)合解離檢測(cè)其親和力。然后通過連續(xù)結(jié)合兩個(gè)靶點(diǎn)，觀察抗體是否可以同時(shí)結(jié)合兩個(gè)抗原（右圖）。  
   iQue®高通量流式檢測(cè)細(xì)胞水平結(jié)合

科研人員使用iQue® 3高通量流式細(xì)胞儀評(píng)估細(xì)胞結(jié)合，并使用儀器配套智能軟件ForeCyt®進(jìn)行分析。iQue®高通量流式具有檢測(cè)速度快，樣品耗量少等特點(diǎn)，是細(xì)胞水平高通量篩選的常用儀器。
  左圖為EGFR高表達(dá)的A431細(xì)胞與雙特異抗體結(jié)合：每孔測(cè)量800-1800個(gè)A431細(xì)胞。在兩個(gè)初始洗滌步驟后，將細(xì)胞和100 nM的bsAbs孵育，洗滌后加入熒光標(biāo)記的Goat Anti-Human IgG和碘化丙啶（標(biāo)記死細(xì)胞）�？梢�，bsAbs可以和A431細(xì)胞結(jié)合。
 
右圖為雙特異抗體與NKp30結(jié)合：檢測(cè)雙特異性抗體是否可以同時(shí)結(jié)合兩個(gè)靶點(diǎn)，在bsAb以100 nM的濃度與A431細(xì)胞孵育和洗滌后，與His標(biāo)簽的NKp30孵育30分鐘。再將細(xì)胞與抗His抗體和碘化丙啶孵育�？梢姡琤sAbs可以同時(shí)結(jié)合A431細(xì)胞和NKp30。
 
Incucyte®實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)殺傷效果

對(duì)于免疫細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)，Incucyte®實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)可以在不移動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)板的情況下，對(duì)細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光拍攝，不需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行懸浮處理，并且具備高通量特性，可同時(shí)放置6塊96或384孔板。 A431細(xì)胞深紅色染料染色。將靶細(xì)胞以20 μL體積以2500個(gè)細(xì)胞/孔接種到384孔透明底部微量滴定板中，并孵育3小時(shí)。以不同的E：T比（即1:1，5:1，10:1和20:1）加入NK細(xì)胞，再加入不同濃度的BsAbs。用綠色凋亡染料進(jìn)行死活細(xì)胞染色，然后在Incucyte®系統(tǒng)中進(jìn)行實(shí)時(shí)在線測(cè)量24小時(shí)。計(jì)算紅綠疊加面積為裂解率。用西妥昔單抗觸發(fā)的最大裂解率或用30 μM星孢菌素培養(yǎng)的靶細(xì)胞進(jìn)行normalization。
可見，活性最佳的幾個(gè)BsAbs顯示出nM級(jí)的EC50殺傷效果（A圖），接近于100%的最大殺傷率（B,C圖）
     賽多利斯生物分析部門始終致力于智能、可靠的高通量藥物表征及篩選方法的開發(fā)。無論在藥物研發(fā)還是在基礎(chǔ)研究中，生物分析三劍客—Octet®分子互作分析系統(tǒng)、iQue®高通量流式細(xì)胞儀和Incucyte®實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)，都能夠分別從分子互作水平、細(xì)胞互作水平和細(xì)胞成像水平中提供更高效，更便捷的解決方案，讓大家在競(jìng)爭(zhēng)激烈的市場(chǎng)中占有一席之地！
 
ADC（抗體偶聯(lián)藥物）開發(fā)
三劍客出馬，助力小細(xì)胞肺癌新藥物發(fā)現(xiàn)

Car-T細(xì)胞治療
【Nature】賽多利斯這對(duì)CP助力CAR-T王炸誕生

基礎(chǔ)科研-病毒學(xué)
【Nature】賽多生物分析三劍客助力甲病毒受體快速發(fā)現(xiàn)


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-參考文獻(xiàn)-
1.Structural Basis of Broad HIV Neutralization by a Vaccine-Induced Cow Antibody. Sci Adv (2020) 6:eaba0468. doi: 10.1126/sciadv.aba0468

2.Grabbing the Bull by Both Horns: Bovine Ultralong CDR-H3 Paratopes Enable Engineering of 'Almost Natural' Common Light Chain Bispecific Antibodies Suitable For Effector Cell Redirection. Frontiers in Immunology, 01 Jan 2021, 12:801368