mRNA疫苗的作用機(jī)制
（圖片來(lái)源：NATURE REVIEWS | Drug Discovery）
 

mRNA藥物在研發(fā)過(guò)程中，其穩(wěn)定性和藥物遞送是需要面臨的主要挑戰(zhàn)。裸露的mRNA很容易受到體內(nèi)RNA切割酶的攻擊，mRNA也需要被高效地遞送至細(xì)胞內(nèi)從而進(jìn)行翻譯，發(fā)揮功能。因此，mRNA藥物的關(guān)鍵技術(shù)為RNA的修飾與遞送。

mRNA藥物前期的研發(fā)工作主要集中在修飾 mRNA 的結(jié)構(gòu)元件上，特別是5’帽區(qū)，5’UTR 和 3’UTR，編碼區(qū)和Poly A 尾，修飾此類結(jié)構(gòu)能有效改善 mRNA 在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性和翻譯效率。除此之外，對(duì)mRNA的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征分析，也是保證 mRNA 安全性和有效性的關(guān)鍵。
 

mRNA藥物的結(jié)構(gòu)
（圖片來(lái)源：NATURE REVIEWS | Drug Discovery）
 

01  加帽率及Poly A 尾檢測(cè)
在mRNA的結(jié)構(gòu)表征上，丹納赫生命科學(xué)擁有使用SCIEX高分辨質(zhì)譜及毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測(cè)的方案。由于mRNA全長(zhǎng)較長(zhǎng)、分子量較大，所以在進(jìn)行加帽率及Poly A 尾檢測(cè)時(shí)，需要通過(guò)酶切的方式獲得5’端的加帽短鏈及3’端的Poly A尾短鏈，然后分別進(jìn)行毛細(xì)管電泳及質(zhì)譜的檢測(cè)。
 

mRNA加帽檢測(cè)前處理
 

PA 800 Plus毛細(xì)管電泳制藥分析系統(tǒng)可以分離獲得加帽和不加帽樣本的分離峰，目前經(jīng)過(guò)優(yōu)化，基本可以得到達(dá)基線分離，從而可以獲得準(zhǔn)確的加帽定量檢測(cè)結(jié)果。對(duì)于100nt以內(nèi)的單鏈核酸，PA 800 Plus可以分辨相差1nt的產(chǎn)物，從而對(duì)Poly A 尾進(jìn)行檢測(cè)。

PA 800 Plus毛細(xì)管電泳制藥分析系統(tǒng)
對(duì)mRNA樣本進(jìn)行加帽率檢測(cè)
 

高分辨質(zhì)譜對(duì)mRNA樣本進(jìn)行加帽率檢測(cè)
 

PA 800 Plus對(duì)mRNA長(zhǎng)度完整性進(jìn)行檢測(cè)

合適的mRNA遞送載體可實(shí)現(xiàn)對(duì)mRNA的高效包載，并在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)良好的表達(dá)效果�；�于脂類或類脂化合物的載體是目前mRNA疫苗最常用的非病毒類載體。各種合成的和天然衍生的脂質(zhì)已經(jīng)被用來(lái)形成脂質(zhì)體或脂質(zhì)納米顆粒（LNP），兩者都被報(bào)道可以有效地遞送基于mRNA的疫苗。

無(wú)論是脂質(zhì)體或是脂質(zhì)納米顆粒包裹mRNA后的顆粒大小、粒徑分布等都是影響遞送效率的最主要的參數(shù)，丹納赫生命科學(xué)擁有對(duì)載藥脂質(zhì)體進(jìn)行不同維度檢測(cè)的方案。

03  載藥顆粒形態(tài)學(xué)觀察
采用冷凍透射電鏡進(jìn)行載藥脂質(zhì)體的檢測(cè)可以直觀地觀察脂質(zhì)體的分布形態(tài)、顆粒大小和顆粒完整度，并且冷凍處理載藥脂質(zhì)體是在生理狀態(tài)下對(duì)載藥脂質(zhì)體進(jìn)行冷凍保存，不會(huì)對(duì)脂質(zhì)體造成破壞，所獲得的結(jié)果更加真實(shí)、清晰、準(zhǔn)確。徠卡顯微系統(tǒng)擁有全套的冷凍制樣設(shè)備，包括對(duì)電鏡載網(wǎng)的噴鍍連續(xù)碳膜和輝光放電處理的EM ACE600，以及能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)樣品安全冷凍的投入冷凍儀EM GP2，可以便捷地完成高質(zhì)量的載藥脂質(zhì)體的冷凍前處理。
 

載藥脂質(zhì)體冷凍透射電鏡圖	Leica 載藥脂質(zhì)體冷凍前處理技術(shù)路線

04  載藥脂質(zhì)體包封率檢測(cè)
另外，還可以采用分析型超速離心機(jī)對(duì)載藥脂質(zhì)體的顆粒大小分布進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算游離與膠囊化藥物的比例，為脂質(zhì)體或是脂質(zhì)納米顆粒與mRNA藥物的混合比例提供指導(dǎo)。采用分析型超速離心機(jī)進(jìn)行載藥脂質(zhì)體檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)是：使載藥脂質(zhì)體保持天然狀態(tài)，沒有破壞性，并且檢測(cè)完后可回收。
 

貝克曼庫(kù)爾特分析型超速離心機(jī)（AUC）
對(duì)載藥脂質(zhì)體進(jìn)行檢測(cè)
 

05  載藥脂質(zhì)體粒度分布檢測(cè)
粒度分布是指在一定的粒徑檢測(cè)范圍內(nèi)，對(duì)脂質(zhì)體顆粒的大小進(jìn)行分析，得到粒徑分布圖和相應(yīng)的粒徑分析結(jié)果（包括中位粒徑D50，平均粒徑Mean Diameter），以此控制生產(chǎn)的脂質(zhì)體顆粒大小，以及用于生產(chǎn)質(zhì)控，保證批次間的一致性。因?yàn)榱６确植伎捎绊懠{米載體體內(nèi)分布從而影響被動(dòng)靶向，所以是檢測(cè)載藥脂質(zhì)體的重要指標(biāo)。貝克曼庫(kù)爾特的LS 13320 XR 激光粒度分析儀采用先進(jìn)的偏振光強(qiáng)度差散射（PIDS）技術(shù)與激光衍射相結(jié)合，可對(duì)納米級(jí)別的載藥脂質(zhì)體粒度分布進(jìn)行精確檢測(cè)。
 

LS 13320 XR 激光粒度分析儀對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行粒度分布檢測(cè)

06  細(xì)胞外囊泡的檢測(cè)
體液中的細(xì)胞外囊泡（EV）是由多種細(xì)胞分泌的攜帶有核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等物質(zhì)的一種納米囊泡，在體內(nèi)可發(fā)揮細(xì)胞通訊和物質(zhì)傳遞的作用。因其具有良好的生物相容性、高生物滲透性和低免疫原性、低毒性等優(yōu)點(diǎn)，被越來(lái)越多地用于mRNA藥物的遞送系統(tǒng)的研究。

流式細(xì)胞儀可以對(duì)EVs和其他生物顆粒（包括病毒和細(xì)菌）進(jìn)行定量和多參數(shù)表征。但實(shí)際上，最靈敏的傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀已被認(rèn)為無(wú)法檢測(cè)到直徑小于300納米的EVs。由于微泡大小的范圍實(shí)際上延伸至150 nm，而外泌體的直徑在30–150 nm之間，因此這導(dǎo)致了一個(gè)共同的認(rèn)知，即流式細(xì)胞儀只能檢測(cè)到EVs的冰山一角。

貝克曼庫(kù)爾特的CytoFLEX系列流式細(xì)胞儀是一種基于半導(dǎo)體集成電路化的流式細(xì)胞儀，將硅雪崩光電二極管（APD）與波分復(fù)用（WDM）結(jié)合，優(yōu)化的流通池設(shè)計(jì)和二極管激光器配對(duì)使信號(hào)強(qiáng)度遠(yuǎn)大于傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀，而噪聲遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀。另外，CytoFLEX上的紫色SSC（VSSC，405 nm）充分提高了小顆粒檢測(cè)的靈敏度。
 

CytoFLEX進(jìn)行外泌體檢測(cè)的結(jié)果
 

（圖D中顯示兩群Annexin-V陽(yáng)性細(xì)胞群標(biāo)記囊泡/外泌體微顆粒。Annexin-V dim在圖中用綠色顯示，該群微顆粒表達(dá)CD41，不表達(dá)或低表達(dá)CD63，且細(xì)胞較��；Annexin-V high在圖中用紅色顯示，該群微顆粒CD41+CD63+，且細(xì)胞相對(duì)較大。）

CytoFLEX流式細(xì)胞儀
 

 

丹納赫生命科學(xué)擁有從質(zhì)粒模板，mRNA結(jié)構(gòu)，到遞送系統(tǒng)一系列的mRNA藥物表征及質(zhì)控方案，能夠有效幫助用戶加快mRNA藥物的研發(fā)進(jìn)度。