肝細(xì)胞維持培養(yǎng)基（HMM）試劑盒使用說(shuō)明書(shū)
本試劑僅供研究使用     
【適用范圍】
本試劑盒用于維持人原代肝細(xì)胞培養(yǎng)，可維持原代肝細(xì)胞（PHH）的形態(tài)和功能長(zhǎng)達(dá)2個(gè)月。
【實(shí)驗(yàn)原理】
本試劑盒采用體外培養(yǎng)方法維持人原代肝細(xì)胞的形態(tài)和功能，由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)添加物等成分組成，含有特定生長(zhǎng)因子和小分子，可有效抑制人原代肝細(xì)胞的衰老、凋亡和去分化，長(zhǎng)期維持肝細(xì)胞的多角形及雙核形態(tài)和結(jié)構(gòu)，保持白蛋白和細(xì)胞色素氧化酶CYP家族等功能蛋白的表達(dá)水平和功能狀態(tài)。在肝細(xì)胞維持培養(yǎng)基中培養(yǎng)人原代肝細(xì)胞的接種密度為2×10⁴-3×10⁴/cm²，可用于體外肝細(xì)胞毒性測(cè)試、HBV病毒感染以及肝病發(fā)生過(guò)程模擬等研究。
【試劑盒的組成】

試劑盒組成	規(guī)格	6孔板/月用量	保存條件	有效期
說(shuō)明書(shū)	1份	/	/	/
基礎(chǔ)培養(yǎng)基（HepX medium）	500ml	110 ml	2-8℃	1年
營(yíng)養(yǎng)添加物（HepSup）	40.8ml	10 ml	-20℃	1年
包被液（HepCoat）	200μl	50 μl	-20℃	1年

【肝細(xì)胞維持培養(yǎng)基（HMM）配制】
120ml肝細(xì)胞維持培養(yǎng)基配制：110 ml HepX medium與10 ml HepSup混勻。
【包被液處理】
使用時(shí)將6孔板及槍頭4℃預(yù)冷，將HepCoat從-20℃冰箱中取出，在4℃解凍，在冰上快速以1:80的比例與HepX medium混勻，然后包被六孔板，每孔包被0.8 ml，放置37℃，30分鐘后取出后吸走多余混合液。
【使用方法】

• 生物安全柜中，將10ml肝細(xì)胞維持培養(yǎng)基加入到15ml離心管中，37℃恒溫水浴鍋預(yù)熱10分鐘。
• 將凍存原代肝細(xì)胞從液氮中迅速轉(zhuǎn)移至37℃恒溫水浴鍋中，在水中順時(shí)針旋轉(zhuǎn)解凍約90-120秒，直至凍存管中只有小塊碎冰漂浮。
• 利用鈍槍頭將細(xì)胞吸出，并以滴加方式轉(zhuǎn)移至10ml預(yù)熱的肝細(xì)胞維持培養(yǎng)基中，輕微上下顛倒2-3次混勻。
• 室溫放置30-45分鐘后（每15分鐘輕輕顛倒混勻一次），再進(jìn)行低速離心（50×g，常溫離心5分鐘），去上清，用5ml肝細(xì)胞維持培養(yǎng)基（HMM）重懸細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定肝細(xì)胞的存活率和細(xì)胞總數(shù)。
• 按活細(xì)胞數(shù)2×10⁴-3×10⁴/cm²（優(yōu)選3×10⁴/cm²）的密度接種到經(jīng)包被的培養(yǎng)板中搖勻，在37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6-8小時(shí)后，觀察細(xì)胞的貼壁狀態(tài)，換液；之后每2天換液一次。

【結(jié)果檢測(cè)】

• 原代肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)

用肝細(xì)胞維持培養(yǎng)基（HMM）進(jìn)行原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)，分別在細(xì)胞培養(yǎng)的第0，3，7，14，21，24，28，35，42，49，56天鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

• 原代肝細(xì)胞功能

分別于細(xì)胞培養(yǎng)的第0，3，7，14，21，24，28，35，42，49，56天留取培養(yǎng)細(xì)胞的上清，分別用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞ALB，AAT分泌水平，尿素檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞尿素合成能力以及氨清除試劑盒檢測(cè)肝細(xì)胞解毒能力。
【結(jié)果判定】

• 通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察，經(jīng)過(guò)56天培養(yǎng)，肝細(xì)胞能維持多角形形態(tài)，基本與原代肝細(xì)胞形態(tài)一致。
• 通過(guò)ELISA方法檢測(cè)，肝細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基可以在56天內(nèi)有效維持肝細(xì)胞對(duì)ALB和AAT的分泌能力，同時(shí)，尿素合成和氨清除能力與原代肝細(xì)胞維持在同一水平。

【注意事項(xiàng)】
          實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。         
          肝細(xì)胞維持培養(yǎng)基2~8℃避光保存。