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多光譜光聲斷層掃描紅外二區(qū)熒光成像診斷間質(zhì)性膀胱炎和肝臟缺血實驗

瀏覽次數(shù)：630　發(fā)布日期：2022-2-15　來源：恒光智影

本文要點：苯并噻二唑核發(fā)色團具有良好的穩(wěn)定性、較大的斯托克偏移和易于擴展發(fā)射到NIR-II范圍等優(yōu)點。然而，在充分發(fā)揮其生物應用潛力之前，還需要克服水溶性差、水溶液中的聚集致猝滅ACQ和非活化反應等障礙，這些熒光團通常是惰性探針，發(fā)出不變的或“一直開著”的信號，構成附加的背景噪音，不能對特定刺激做出反應，無法實現(xiàn)生物標志物激活的檢測或成像。在本研究中，作者設計了一種可激活的苯并噻二唑核納米探針BTPE-NO2@F127,此探針具有AIE特性，通過整合生物標記物響應部分和采用封裝分子探針的自組裝設計策略克服上述障礙，該納米探針用于體內(nèi)NIR-II熒光成像和MSOT成像能夠原位響應曲唑酮誘導的肝損傷，肝缺血再灌注損傷（I/R）和間質(zhì)性膀胱炎小鼠模型中的H2O2生物標志物進而進行檢測和成像，此外，獲得的三維MSOT圖像有利于三維信息的疾病部位可視化。

納米探針BTPE-NO2@F127的合成策略如圖1所示，將苯并噻二唑核與兩個四苯基作為疏水分子轉子連接，然后在核兩端加入兩個硝基苯氧乙酰胺單元作為識別基團和熒光猝滅劑。然后使用經(jīng)FDA批準的兩親性聚合物Pluronic F127來封裝BTPE-NO2分子，以生成納米探針BTPE-NO2@F127。

圖1：納米探針BTPE-NO2@F127的制備及其應用（間質(zhì)性膀胱炎、曲唑酮誘導的肝損傷和小鼠肝臟I/R損傷）示意圖。

隨后，作者對合成的納米探針進行表征如圖2所示，為了驗證BTPE-NH2的AIE特性，測量了其在二甲基亞砜(DMSO)/水(好溶劑:DMSO，差溶劑:水)的混合物中隨水餾分變化的熒光強度。改變水餾分可以微調(diào)溶劑混合物的溶解能力，相應地調(diào)整BTPE - NH2的聚集程度。如圖2a、b所示，隨著水餾分的增加，BTPE- NH2溶液的發(fā)射強度明顯增加，表現(xiàn)出典型的AIE特征。當水含量達到99%時，BTPE-NH2的熒光強度比DMSO溶液增強12.8倍。由于探針BTPE-NO2具有較強的疏水性和較高的共軛性，經(jīng)Pluronic F127封裝后可獲得較高的封裝效率(98%)，BTPE-NO2在納米探針BTPE-NO2@F127中的負載能力為9.3%。透射電子顯微鏡(TEM)顯示納米探針BTPE-NO2@F127具有相對均勻的球形形貌，直徑約為37 nm(圖2c)，動態(tài)光散射(DLS)測量的納米探針BTPE-NO2@F127的粒徑分布如圖2c所示。在37℃下在PBS (10 mM, pH=7.4)中測量不同濃度的H2O2處理BTPE-NO2@F127后的光譜(圖2d-g)。1028 nm處的熒光強度隨著H2O2濃度的增加而增加(圖2d-g)，而納米探針BTPE-NO2@F127在沒有H2O2的情況下發(fā)射微弱。納米探針BTPENO2@F127在H2O2孵育前后的吸收光譜如圖2f所示。在對H2O2反應之前，該納米探針BTPENO2@F127在615 nm處表現(xiàn)出最大的吸收。對H2O2反應后，最大吸收紅移至約680 nm，吸收帶范圍為600 ~ 850 nm。從圖2f, g中可以明顯看出，隨著H2O2濃度的增加，吸收光譜發(fā)生紅移，680 ~ 850 nm處的吸光度明顯增加。這些數(shù)據(jù)清楚地表明，熒光強度的增加是由于探針對H2O2的響應。BTPE-NO2@F127納米探針在680-900 nm范圍內(nèi)與不同濃度的H2O2孵育后的光聲強度見圖2h。光聲強度與H2O2濃度(0 ~ 100μm)呈明顯的線性關系(圖2h)。此外，在808 nm激光連續(xù)照射60分鐘(圖2i)下，納米探針BTPE-NO2@F127與H2O2和其可激活形式BTPE - NH2相比，具有更好的光穩(wěn)定性。

圖2：納米探針的表征。(a) BTPE-NH2在DMSO/H2O混合物中與不同水組分的NIR-II熒光光譜。(b) BTPE- NH2的熒光強度與水餾分的關系圖。(c)納米探針的DLS和TEM圖像。(d)BTPE-NO2@F127與不同濃度H2O2孵育90分鐘后的NIR-II熒光光譜。(e)納米探針在不同濃度的H2O2處理后在1028nm處的熒光強度。(f )BTPE-NO2@F127在不同濃度的H2O2中的吸收光譜。(g)納米探針BTPE-NO2@F127在不同H2O2水平下的吸光度。(h)納米探針與不同濃度的H2O2孵育后的相對光聲強度(i)BTPE-NH2、BTPE - NO2與H2O2、ICG共孵育的光穩(wěn)定性。

基于上述令人鼓舞的結果，證實了納米探針BTPE-NO2@F127可以有效地響應H2O2，從而產(chǎn)生NIR-II熒光和光聲信號，作者將該納米探針應用于幾種炎癥疾病的診斷。圖3和圖4顯示了利用BTPENO2@F127探針對間質(zhì)性膀胱炎小鼠模型進行成像。間質(zhì)性膀胱炎是一種以盆腔疼痛、尿頻尿急為特征的膀胱炎癥性疾病。這種疾病很難診斷，因為目前還沒有專門的臨床試驗來診斷這種疾病。間質(zhì)性膀胱炎患者膀胱內(nèi)活性氧(包括H2O2)的生成增強，因此H2O2可作為該疾病的原位生物標志物。因此，作者可以使用納米探針BTPE-NO2@F127通過響應原位生物標志物H2O2來診斷間質(zhì)性膀胱炎。環(huán)磷酰胺(CYP，商品名Cytoxan或Neosar)是一種FDA批準的化療藥物，誘導間質(zhì)性膀胱炎是其眾所周知的不良反應之一。因此，我們通過腹腔注射不同劑量的CYP建立間質(zhì)性膀胱炎小鼠模型。如圖3a所示，當雌性小鼠腹腔注射CYP 24小時后，將納米探針BTPE-NO2@F127注射到小鼠體內(nèi)，然后進行NIR-II熒光成像和MSOT成像。從NIR-II熒光成像結果(圖3b)可以看出，熒光強度隨時間逐漸增加，在注射BTPENO2@F127后約90min達到最大，然后由于代謝作用逐漸減弱。膀胱內(nèi)過表達的H2O2激活納米探針，發(fā)出NIR-II熒光信號。在BTPE-NO2@F127注射90 min后，高劑量CYP組(150 mg/kg)比低劑量CYP組(75 mg/kg)和正常對照組(健康小鼠)表現(xiàn)出更高的熒光強度，提示高劑量CYP對膀胱區(qū)域造成更嚴重的損傷。

圖3：納米探針BTPE-NO2@F127通過NIR-II熒光成像在間質(zhì)性膀胱炎小鼠模型中的應用。(a)間質(zhì)性膀胱炎小鼠模型建立及成像實驗示意圖。(b)在BTPE-NO2@F127注射后不同時間點NIR-II成像。

用BTPENO2@F127探針對間質(zhì)性膀胱炎小鼠模型進行MOST成像（圖4a）,對對照組和間質(zhì)性膀胱炎模型小鼠的膀胱組織進行組織學分析(H&E染色)(圖4b)。可以清楚的看到，在CYP治療的模型組中，可以觀察到出血、水腫和尿路上皮脫落，且CYP劑量越大，情況越嚴重。這些結果證實了納米探針BTPENO2@F127可以通過響應原位生物標志物H2O2來檢測膀胱炎癥，從而通過NIR-II熒光和MSOT成像對間質(zhì)性膀胱炎進行無創(chuàng)診斷。

圖4：納米探針BTPE-NO2@F127在間質(zhì)性膀胱炎小鼠模型中的MSOT成像應用(a)和H&E分析(b)

用BTPE-NO2@F127探針對肝損傷小鼠模型成像結果如圖5所示。曲唑酮是臨床用于治療抑郁癥的藥物，日劑量過大會引起肝損傷。眾所周知，在肝損傷時，ROS在肝區(qū)過表達，因此肝臟H2O2可作為肝損傷或損傷的內(nèi)源性生物標志物。用曲唑酮(其結構如圖5a所示)連續(xù)3天腹腔注射不同劑量的曲唑酮刺激雄性小鼠肝損傷。最后一次注射曲唑酮后6 h(第三天)，采用Elisa試劑盒檢測各組血清ALT水平。觀察到小鼠血清ALT水平隨曲唑酮劑量的增加而升高(圖5b)，證實了肝損傷的嚴重程度隨曲唑酮劑量的增加而增加。接下來，我們使用納米探針BTPE-NO2@F127來成像肝臟損傷。圖5c顯示了對照組和給予不同劑量曲唑酮組小鼠靜脈注射BTPE-NO2@F127后0分鐘和120分鐘時的NIR-II熒光圖像。曲唑酮組小鼠在注射納米探針BTPE-NO2@F127前0 min無熒光，注射納米探針BTPENO2@F127后120 min，熒光強度隨曲唑酮劑量的增加而增加。圖5d給出了肝臟區(qū)域感興趣區(qū)域(ROI)的量化強度(圖5c)，為熒光圖像提供了直觀的數(shù)據(jù)。納米探針BTPE-NO2@F127作用120min后，不同組小鼠切除器官(腎、心、肝、肺和脾)的熒光強度如圖5e所示，這些器官的NIR-II熒光圖像如圖5f所示。肝臟的熒光明顯強于心、脾、肺、腎等其他主要器官，不同劑量曲唑酮處理組的熒光強度呈劑量依賴性。圖5g為不同組小鼠肝臟區(qū)域的三維正交視圖MSOT圖像，能夠反映不同組小鼠肝臟損傷的三維信息�？梢�，未注射曲唑酮的小鼠在注射納米探針后，肝臟區(qū)域出現(xiàn)微弱的MSOT信號，這是由于健康小鼠肝臟區(qū)域存在較低的ROS(包括H2O2)水平。實驗組接受不同數(shù)量的曲唑酮(50,100或200mg/kg)治療,在他們的肝臟區(qū)域發(fā)現(xiàn)顯著MSOT信號, 高劑量曲唑酮治療組小鼠的信號更強,表明高曲唑酮劑量的小鼠遭受更嚴重的肝損傷。這些結果表明，MSOT成像可以在時空上檢測肝損傷引起的肝區(qū)H2O2水平的升高。隨后，分別對給予0、50、100和200 mg /kg 曲唑酮預處理的小鼠實施安樂死，獲得其肝臟組織，對不同組小鼠肝臟組織切片進行組織學分析(H&E染色)(圖5h)。對照組肝組織切片顯示形態(tài)正常，無明顯畸變，而曲唑酮組肝組織切片顯示核胞漿分離、空泡化和水變性，這表明高劑量曲唑酮可加重肝損傷的嚴重程度。

圖5：納米探針BTPE-NO2@F127在曲唑酮肝損傷小鼠模型中的應用。(a)曲唑酮的分子結構。(b)各組血清谷丙轉氨酶水平。(c)鹵素燈(作為亮場圖像)和NIR-II熒光圖像。(d )c組小鼠肝臟部位ROI處平均NIR-II熒光強度。(e) f對應NIR-II熒光圖像的主要器官NIR-II熒光強度均值。(f)不同組在靜脈注射BTPE-NO2@F127后120分鐘內(nèi)解剖器官(心、肝、脾、肺、腎)的代表性離體NIR-II熒光圖像。(g) BTPE-NO2@F127注射后120分鐘小鼠的典型3D MSOT圖像。(h)各組肝切片H&E染色

此外，作者使用納米探針來成像肝缺血再灌注損傷(I/R)。肝缺血再灌注損傷(I/R)是臨床各種情況下的主要并發(fā)癥，如肝切除術、肝移植、失血性休克、復蘇和創(chuàng)傷手術等，也是肝移植排斥反應導致死亡的主要原因。在肝I/R損傷的情況下，ROS(包括H2O2)在肝區(qū)過表達，導致局部炎癥反應和細胞凋亡，進一步加重肝損傷。在這里，作者利用納米探針BTPENO2@F127檢測其對肝臟H2O2響應的肝損傷程度。小鼠分別缺血0 min(假手術組為對照組)、30 min或60 min，然后再灌注24 h。圖6a為小鼠肝臟I/R過程。在缺血的情況下，肝臟因供血受阻而呈蒼白色，取下血管鉗，可見血流灌注明顯。將納米探針BTPE-NO2@F127靜脈注射到假手術組和I/R模型組小鼠，分別進行MSOT成像和NIR-II熒光成像。老鼠的肝臟區(qū)域的NIR-II熒光圖像和熒光強度顯示在圖6 b, c。假手術組小鼠的肝臟區(qū)域顯示微弱熒光，I/R模型組在注射納米探針BTPE-NO2@F127后90分鐘或120分鐘時肝臟的缺血區(qū)域顯示明顯的熒光。長時間缺血組(缺血60min)比短時間缺血組(缺血30min)熒光強度更高，這是因為長時間缺血組肝臟產(chǎn)生的H2O2更多，缺血時間更長，相應的肝臟損傷更嚴重。在I/R過程中缺血30min或60min組(圖6d)，肝臟主要器官之間的熒光更強，這與體內(nèi)成像結果一致。

圖6：納米探針BTPE-NO2@F127通過NIR-II熒光成像在肝臟缺血-再灌注損傷小鼠模型中的應用。(a) I/R過程手術照片(b)假手術組(缺血0分鐘)和I/R模型小鼠(缺血30分鐘或60分鐘后再灌注24小時)靜脈注射BTPE-NO2@F127納米探針后不同時間點的NIR-II熒光圖像。(c) b對應ROI(藍圈)的肝臟區(qū)域的平均NIR-II熒光強度。(d)不同小鼠組在靜脈注射BTPENO2@F127納米探針120 min后解剖主要器官(腎、肺、脾、心、肝)的代表性離體NIR-II圖像。I缺血，R再灌注。

然后，利用納米探針BTPE-NO2@F127進行MSOT成像檢測肝臟I/R損傷。相關數(shù)據(jù)如圖7a所示。圖7a為不同組小鼠靜脈注射BTPE-NO2@F127后不同時間點的MSOT橫切面圖像。肝臟區(qū)域ROI MSOT強度的量化數(shù)據(jù)見圖7b。作為器官位置的參考，雄性小鼠對應于小鼠肝臟區(qū)域的冷凍切片圖像如圖7c所示。對照組(假手術組)在靜脈注射BTPE-NO2@F127納米探針后120 min肝區(qū)未出現(xiàn)明顯的MSOT信號(圖7a、b)，而缺血組小鼠在120 min時出現(xiàn)明顯的MSOT信號，提示肝損傷的形成。長缺血組(缺血60min)肝區(qū)信號較對照組(缺血0min)和短缺血組(缺血30min)明顯。為了驗證I/R過程與肝損傷的關系，我們用Elisa試劑盒測定了血清中ALT和AST的酶活性。I/R過程導致這些血清酶活性顯著增強(圖7d)，證明肝功能障礙與I/R過程確實存在直接相關性，結果與文獻報道相似。圖7e為I/R過程不同組小鼠(sham組、shore缺血組、long缺血組)靜脈注射納米探針BTPENO2@F127后120 min的3D MSOT圖像。接受I / R組長時間缺血(60分鐘),受傷的肝臟可以明顯觀察到MSOT信號很強,這是由于長時間缺血受傷的肝臟的體積(大小)大于短時間缺血(30分鐘)的肝損傷體積。然后，對安樂死后不同組小鼠解剖器官進行MSOT成像(附圖41、42)。缺血30、60 min的I/R組肝臟MSOT信號明顯高于其他器官，驗證了體內(nèi)成像觀察結果。并對不同組小鼠的肝臟進行切片組織學分析(圖7f)。與假手術組相比，長缺血組(60 min)和短缺血組(30 min)炎癥細胞浸潤和空泡變性明顯，且長缺血組較短缺血組更為嚴重。提示I/R過程小鼠肝損傷嚴重。

圖7：納米探針BTPE-NO2@F127在MSOT成像小鼠肝臟缺血-再灌注損傷模型中的應用。

(a)不同組在靜脈注射納米探針BTPE-NO2@F127后0min和120min MSOT圖像(I缺血，R再灌注)。器官標記:“1”代表脊髓。(b) a.對應ROI(白色虛線)的平均MSOT強度。(c)雄性小鼠冷凍切片圖像(d)各組小鼠血清ALT、AST兩種酶水平。(e)BTPE-NO2@F127納米探針注射后120分鐘，不同組的典型3D MSOT圖像。“1”代表脊髓。(f)各組小鼠肝臟切片代表性H&E染色I缺血，R再灌注，MSOT多光譜光聲斷層掃描。

參考文獻

Chen Junjie, etal."A H2O2-activatable nanoprobe for diagnosing interstitialcystitis and liver ischemia-reperfusion injury via multispectral optoacoustictomography and NIR-II fluorescent imaging." NatureCommunications 12.1(2021): doi:10.1038/S41467-021-27233-4.

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