“Tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，可促進(jìn)神經(jīng)元微管的組裝和穩(wěn)定性。tau蛋白積聚為不溶性聚集物，稱為神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs)，由于tau蛋白聚集而造成的幾種神經(jīng)退行性疾病統(tǒng)稱為tauopathies。

 

科學(xué)家普遍認(rèn)為在非功能性蛋白形成之前，小的可溶性tau蛋白寡聚物會(huì)引起毒性。然而到目前為止，現(xiàn)有的技術(shù)還不能在生理或病理?xiàng)l件下對(duì)tau蛋白單體和其寡聚物在細(xì)胞內(nèi)的空間分布做到可視化。在這里，我們使用新一代超分辨顯微鏡，發(fā)現(xiàn)了tau蛋白在微管上形成低聚復(fù)合物，這些低聚復(fù)合物不同于那些在顯示tau蛋白聚集的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的蛋白寡聚物，這可能是病理中聚集tau蛋白的前體。”

 

作者在本文中構(gòu)建了多種不同的細(xì)胞模型，并對(duì)微管上的tau蛋白低聚復(fù)合物在納米尺度上進(jìn)行了詳細(xì)、定量的表征，為研究tau蛋白在體內(nèi)聚集的機(jī)制以及篩選出可能的作用靶點(diǎn)和開發(fā)破壞這些病理性寡聚物的藥物打開了大門。 

 

《Tau forms oligomeric complexes on microtubules that are distinct from tau aggregates》

 

01
研究結(jié)果

 

1. 在非聚集條件下微管相關(guān)的tau蛋白是部分低聚復(fù)合物

 

為了確定非聚集條件下與微管相關(guān)的tau蛋白如何分布，作者在各種工程細(xì)胞模型中進(jìn)行了單分子定位顯微鏡(SMLM)：一個(gè)穩(wěn)定的BSC-1細(xì)胞系，融合有綠色熒光蛋白，并組成性地表達(dá)野生型(WT) tau蛋白的3R亞型(GFP; BSC-1 3R-WT-GFP tau)；瞬時(shí)表達(dá)WT- tau 4R亞型，且融合有GFP的BSC-1細(xì)胞(BSC-1 4R-WT-GFP tau)；以及在多西環(huán)素(Dox)控制下穩(wěn)定表達(dá)FTDP-17突變的GFP標(biāo)記的QBI-293細(xì)胞株(QBI-293 Clone4.0 4R-P301L-GFP tau,以下稱Clone 4.0)。

 

正如預(yù)期的那樣，tau的表達(dá)導(dǎo)致了微管密度和微管捆綁的增加，這與已知的tau蛋白促進(jìn)微管聚合和捆綁的功能一致。作者的分析表明，觀察到的tau納米團(tuán)簇包含有與微管相關(guān)的tau低聚分子，在神經(jīng)元生理?xiàng)l件和工程細(xì)胞系非聚集條件下，tau蛋白主要與微管相關(guān)，與微管相關(guān)的部分tau蛋白形成二聚體和三聚體復(fù)合物。

 

圖1. 在非聚集條件下微管相關(guān)的tau蛋白是部分低聚復(fù)合物
 

A．在表達(dá)4RP301L- GFP tau的Clone 4.0細(xì)胞（QBI-293 Clone 4.0 4R-P301L-GFP tau）中，經(jīng)過Dox誘導(dǎo)tau蛋白表達(dá)后，用Alexa Fluor 647偶聯(lián)的GFP納米抗體染色得到tau蛋白的超分辨率圖像；B. 穩(wěn)定表達(dá)3R-WT-GFP tau蛋白的BSC-1細(xì)胞中，用Alexa Fluor 647偶聯(lián)的GFP納米抗體染色后得到的tau蛋白的超分辨率圖像；C. 利用tau低聚物特異性T22抗體在表達(dá)4R-P301L-GFP tau的克隆4.0細(xì)胞中檢測(cè)tau寡聚物的超分辨率圖像；D. 在不同細(xì)胞系中的tau蛋白納米團(tuán)簇；E. 經(jīng)過Dox誘導(dǎo)tau蛋白表達(dá)后，表達(dá)4R-P301L-GFP tau蛋白的Clone 4.0細(xì)胞中α-tubulin(洋紅色)、總tau蛋白(青色)的雙色超分辨率共定位圖像；F. 經(jīng)過Dox誘導(dǎo)tau蛋白表達(dá)后，在表達(dá)4R-P301L-GFP tau的Clone 4.0細(xì)胞中tau低聚物特異性T22抗體(洋紅色)、總tau蛋白(青色)的雙色超分辨率共定位圖像；G. tau納米團(tuán)簇與α-tubulin、T22、Thr231和AT8抗體共定位的百分比；H.用能夠檢測(cè)所有tau蛋白亞型的tau-5抗體染色后得到的大鼠海馬神經(jīng)元中tau蛋白的超分辨圖像；I.用tau低聚物特異性T22抗體檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元中tau低聚物的超分辨圖像。

 

2.  細(xì)胞中展示出Tau聚集特性的Tau低聚物與非聚集Tau細(xì)胞模型中的Tau低聚物不同  

 

為了確定tau蛋白聚集物的納米尺度上的分布和組成，作者使用了一個(gè)工程細(xì)胞系來(lái)模擬tau蛋白聚集：在Dox誘導(dǎo)下表達(dá)4R-P301L-GFP tau蛋白的QBI-293 Clone4.1細(xì)胞，將其稱為Clone 4.1，它是Clone 4.0的一個(gè)亞克隆，通過體外重組tau纖維外源性轉(zhuǎn)導(dǎo)親本克隆(Clone 4.0)誘導(dǎo)tau聚集而獲得，在Dox存在時(shí)，它能穩(wěn)定地維持tau聚集。為了再次確定這些聚集的tau細(xì)胞中的低聚tau蛋白的百分比以及胞質(zhì)和微管相關(guān)tau蛋白的數(shù)量，我們對(duì)tau與α-tubulin/ T22分別進(jìn)行了雙色超分辨成像。結(jié)果表明，在含有tau聚集物的細(xì)胞中存在有大于3個(gè)tau蛋白組成的寡聚體，這些聚集物在非聚集條件下不存在，并且部分與微管相關(guān)。此外，在FTDP-17細(xì)胞模型中，不同范圍的較大tau聚集物一起破壞了微管網(wǎng)絡(luò)的完整性。  

 

圖2. 含有Tau聚集體的細(xì)胞中的Tau寡聚體與非聚集Tau細(xì)胞模型中的Tau寡聚體不同
 

A. 在經(jīng)過DOX誘導(dǎo)tau蛋白表達(dá)后，穩(wěn)定表達(dá)4R-P301L-GFP的Clone 4.1細(xì)胞中，tau蛋白低聚物復(fù)合體的超分辨圖像；B. Clone 4.0與Clone 4.1細(xì)胞系中tau蛋白納米團(tuán)簇分布對(duì)比；C. 在經(jīng)過DOX誘導(dǎo)tau蛋白表達(dá)后，穩(wěn)定表達(dá)4R-P301L-GFP的Clone 4.1細(xì)胞中，α-tubulin(洋紅色)、總tau蛋白(青色)的雙色超分辨率共定位圖像；D. 在經(jīng)過DOX誘導(dǎo)tau蛋白表達(dá)后，穩(wěn)定表達(dá)4R-P301L-GFP的Clone 4.1細(xì)胞中, 通過tau寡聚物特異性T22抗體(洋紅色)、總tau(青色)，檢測(cè)到的tau蛋白低聚物復(fù)合體；E. Clone 4.0與Clone 4.1細(xì)胞系中tau蛋白納米團(tuán)簇與微管蛋白共定位分布對(duì)比。

 

02
研究總結(jié)

 

本項(xiàng)研究于2021年5月發(fā)表在PNAS雜志上，研究者主要借助STORM技術(shù)來(lái)破譯tau蛋白聚集的奧秘。文中用到的新一代超分辨熒光顯微鏡系統(tǒng)Nanoimager，集成了3D隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)技術(shù)（3dSTORM）、雙通道同時(shí)成像技術(shù)等，以納米級(jí)觀測(cè)精度、高穩(wěn)定性、廣泛環(huán)境適用、快速成像、簡(jiǎn)易操作等優(yōu)異特性，獲得了超過50家科研小組和100多位科研人員的高度認(rèn)可。

 

03
參考文獻(xiàn)

 

1. Gyparaki, M. T., et al. (2021). "Tau forms oligomeric complexes on microtubules that are distinct from tau aggregates." Proceedings of the National Academy of Sciences 118(19): e2021461118.

 

 

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