蛋白質(zhì)免疫印跡是檢測(cè)復(fù)雜混合物中蛋白質(zhì)抗原的常用技術(shù)。通過(guò) SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品，然后將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上。這些膜與特定于目標(biāo)蛋白質(zhì)的抗體一起孵育，該抗體與固定在膜上的蛋白質(zhì)條帶結(jié)合。然后使用檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)抗體進(jìn)行可視化，該系統(tǒng)通常基于與 Ig 鏈結(jié)合的二級(jí)蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)與顯色反應(yīng)相關(guān)。

與理論預(yù)測(cè)相反，檢測(cè)到幾個(gè)波段的情況并不少見(jiàn)。雖然抗體可能并不完全針對(duì)蛋白質(zhì)，但其他因素可能是原因：



1. 抗原的蛋白水解分解。
這種情況并不少見(jiàn)，特別是如果樣品儲(chǔ)存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，或者在起始組織均質(zhì)化后分離蛋白質(zhì)或膜。所有附加條帶的表觀分子量均低于全長(zhǎng)蛋白質(zhì)。特別易感的是突觸蛋白和突觸結(jié)合蛋白。應(yīng)考慮添加蛋白酶抑制劑，如 PMSF、胃蛋白酶抑制劑或亮抑酶肽。 

2. 每條泳道蛋白質(zhì)過(guò)多或檢測(cè)系統(tǒng)過(guò)于敏感。
蛋白質(zhì)免疫印跡法中，凝膠過(guò)載是“鬼帶”的常見(jiàn)原因之一。固定的蛋白質(zhì)可以提供一個(gè)集中的吸附表面，某些 IgG 可以非特異性地結(jié)合到該表面。類(lèi)似地，當(dāng)使用高度靈敏的檢測(cè)系統(tǒng)（例如增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光）時(shí)，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)這種非特異性結(jié)合。起始材料的一系列稀釋通常會(huì)澄清哪些信號(hào)是人為的。

3.低效阻塞。
實(shí)驗(yàn)中會(huì)應(yīng)用到多種不同的封閉劑，某些非離子去污劑或蛋白質(zhì)等封閉劑容易產(chǎn)生低效阻塞的影響。如果改變阻塞條件就可以解決此問(wèn)題。

4. 抗原濃度過(guò)低。
SDS-PAGE 的分辨率一般限制在 50-100 個(gè)波段。如果抗原的相對(duì)濃度過(guò)低（小于總蛋白的 0.2%），則可能難以檢測(cè)（例如，突觸釋放蛋白/VAMP 與細(xì)胞勻漿中的組蛋白共遷移，干擾其檢測(cè)）。信號(hào)增強(qiáng)可能會(huì)導(dǎo)致人工帶的出現(xiàn)。因此可以適當(dāng)考慮通過(guò)分級(jí)分離或免疫沉淀富集抗原。