眾所周知，機(jī)械負(fù)荷可以改善肌腱愈合。承受負(fù)荷的愈合肌腱會(huì)變得強(qiáng)壯幾倍，但其內(nèi)在機(jī)制尚不完全清楚。
 

細(xì)胞之間的分泌組串?dāng)_會(huì)誘導(dǎo)多種功能，例如細(xì)胞增殖、遷移、膠原蛋白生成和細(xì)胞分化。來自機(jī)械加載的肌肉細(xì)胞的分泌組已被證明含有增加水平的生長因子，如成纖維細(xì)胞生長因子 (FGF)，它可能與肌腱細(xì)胞表達(dá)的受體結(jié)合以改善愈合過程。這些表明肌肉分泌組可能會(huì)改善肌腱愈合。
 

已知機(jī)械負(fù)荷的臨床變化對肌腱愈合有不同的影響。然而，不同的負(fù)荷方案是否會(huì)影響肌細(xì)胞分泌組，從而導(dǎo)致肌腱愈合的不同結(jié)果尚不清楚。
 

肌腱愈合過程包括三個(gè)重疊階段：炎癥、增殖和重塑。有研究發(fā)現(xiàn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分泌因子增強(qiáng)肌腱細(xì)胞的遷移和增殖，這表明肌腱細(xì)胞對來自其他密切相關(guān)細(xì)胞的分泌因子有反應(yīng)。骨骼肌細(xì)胞的分泌組包含許多與遷移和增殖相關(guān)的生長因子和細(xì)胞因子。
 

在重塑階段的后期，有一個(gè)由肌腱細(xì)胞產(chǎn)生的膠原蛋白I (Col I) 和少量的膠原蛋白III (Col III) 主導(dǎo)的更致密的結(jié)締組織。因此，使用 Col I/III 的比值來分析肌腱愈合不同階段的膠原蛋白成分。
 

肌腱細(xì)胞的分化有很多特征標(biāo)志物。Tenascin-C (Tnc) 和波形蛋白 (Vim) 以及 Scx 是通常用于識(shí)別肌腱細(xì)胞的標(biāo)志物。S100 鈣結(jié)合蛋白 A4 (S100a4) 和 Alpha-Actin smooth muscle 蛋白（Acta2，也稱為 α-SMA）是兩個(gè)與肌腱愈合相關(guān)的標(biāo)志物。有研究表明，表達(dá) S100a4 的成纖維細(xì)胞與纖維化肌腱愈合呈正相關(guān)。CD146 (Mcam) 是肌腱干/祖細(xì)胞的標(biāo)志物。因此，分析 Col I/III 比值和表型標(biāo)記 Scx、Tnc、Vim、Acta2 和 S100a4 有助于理解肌腱愈合。
 

基于此，瑞典于默奧大學(xué)醫(yī)學(xué)院綜合醫(yī)學(xué)生物學(xué)系、社區(qū)醫(yī)學(xué)與康復(fù)學(xué)系的專家學(xué)者進(jìn)行了深入研究，他們假設(shè) (1) 來自成肌細(xì)胞的分泌組影響肌腱細(xì)胞和與肌腱愈合相關(guān)的參數(shù)，以及 (2) 不同的成肌細(xì)胞機(jī)械負(fù)荷方案在肌腱細(xì)胞中誘導(dǎo)不同的反應(yīng)。
 

實(shí)驗(yàn)研究了與肌腱愈合相關(guān)的參數(shù)，包括 (i) 遷移、(ii) 增殖 (iii) 細(xì)胞表型和 (iv) 膠原蛋白生成。為了克服體內(nèi)系統(tǒng)的復(fù)雜性，使用體外間接共培養(yǎng)系統(tǒng)，在成肌細(xì)胞存在的情況下培養(yǎng)肌腱細(xì)胞來測試假設(shè)，使用拉力系統(tǒng)機(jī)械加載成肌細(xì)胞。

根據(jù)初步數(shù)據(jù)，細(xì)胞在頻率為 1Hz 的情況下接受 5% 的等雙軸動(dòng)態(tài)拉伸應(yīng)變或著恒定的靜應(yīng)變。將細(xì)胞拉伸 1h，然后間隔 2h。重復(fù)此加載 3 次，然后間隔 4h。一個(gè)周期共耗時(shí) 13h。該方案重復(fù)試驗(yàn) 24h 或 48h。
 

靜態(tài)負(fù)荷的成肌細(xì)胞的分泌組促進(jìn)肌腱細(xì)胞遷移
 

實(shí)驗(yàn)首先檢查了成肌細(xì)胞分泌組與機(jī)械卸載的成肌細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)對肌腱細(xì)胞遷移的影響。與單獨(dú)培養(yǎng)的腱細(xì)胞相比，與肌腱細(xì)胞共培養(yǎng)的成肌細(xì)胞在 24h 后顯著降低了肌腱細(xì)胞的遷移（圖1A 左）；然而，這種效果在 48h 后未見（圖1B  左）。
 

接下來測試了成肌細(xì)胞的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)負(fù)荷是否會(huì)影響肌腱細(xì)胞遷移。與卸載的成肌細(xì)胞相比，動(dòng)態(tài)加載的成肌細(xì)胞在 24h 或 48h 不影響肌腱細(xì)胞遷移。然而，與未加載的成肌細(xì)胞相比，靜態(tài)加載的成肌細(xì)胞在 24h 和 48h 都顯著增強(qiáng)了肌腱細(xì)胞的遷移（圖1A、B  右）。
 

數(shù)據(jù)表明，相對于成肌細(xì)胞上的負(fù)荷類型，肌腱細(xì)胞遷移能力有不同的反應(yīng)。此外，來自靜態(tài)加載的成肌細(xì)胞的分泌組確實(shí)會(huì)誘導(dǎo)肌腱細(xì)胞的遷移。
 

圖1 與/不與機(jī)械加載的成肌細(xì)胞共培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞的細(xì)胞遷移。

機(jī)械加載的成肌細(xì)胞對肌腱細(xì)胞增殖和凋亡沒有影響
 

實(shí)驗(yàn)使用 EdU 染色來量化肌腱細(xì)胞的增殖率。在 24h 和 4h 各組間未檢測到增殖的顯著差異。此外，在 48h 的蛋白質(zhì)印跡中未發(fā)現(xiàn)增殖標(biāo)記物增殖細(xì)胞核抗原 (PCNA) 的顯著差異。
 

接下來使用乳酸脫氫酶 (LDH) 檢測來量化肌腱細(xì)胞中的細(xì)胞死亡。24h 和 48h 各組間 LDH 水平無顯著差異，表明沒有誘導(dǎo)肌腱細(xì)胞的凋亡和/或壞死。蛋白質(zhì)印跡進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果，它顯示 cleaved-Poly（ADP-ribose）polymerase（c-PARP）無顯著差異，這是晚期凋亡活性的標(biāo)志物。
 

機(jī)械加載成肌細(xì)胞的分泌組改變肌腱細(xì)胞的膠原蛋白表達(dá)
 

為了檢測卸載或機(jī)械加載的成肌細(xì)胞是否影響肌腱細(xì)胞膠原蛋白的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)測量了 mRNA 水平的 Col 1a1 和 Col 3a1 以及細(xì)胞內(nèi) Col I 和 Col III 的濃度，以及分泌到培養(yǎng)基中的濃度。結(jié)果表明，來自卸載的成肌細(xì)胞的分泌組在 mRNA 和蛋白質(zhì)分泌水平上可以調(diào)節(jié)肌腱細(xì)胞中的 Col I/III 比值。
 

接下來，研究人員確定了不同的機(jī)械加載方案是否會(huì)影響共培養(yǎng)系統(tǒng)中的膠原蛋白生成。靜態(tài)或動(dòng)態(tài)加載成肌細(xì)胞24h后均未改變腱細(xì)胞中 Col 1a1 mRNA 的表達(dá)。相比之下，與動(dòng)態(tài)和靜態(tài)加載的成肌細(xì)胞共培養(yǎng)后，肌腱細(xì)胞中的 Col 3a1 mRNA 表達(dá)顯著降低。機(jī)械加載的成肌細(xì)胞的分泌組沒有改變細(xì)胞內(nèi)的 Col I 含量。
 

與未加載的成肌細(xì)胞組相比，動(dòng)態(tài)加載的成肌細(xì)胞組在 24h 時(shí)的培養(yǎng)基中 Col I 和 Col III 的濃度顯著降低，靜態(tài)加載的成肌細(xì)胞組在 48h 時(shí)的培養(yǎng)基中 Col I 和 Col III 的濃度顯著降低。
 

總的來說，這些結(jié)果表明成肌細(xì)胞分泌組改變了培養(yǎng)基中 Col I 和 Col III 的濃度，成肌細(xì)胞的機(jī)械負(fù)荷改變了肌腱細(xì)胞中膠原蛋白的產(chǎn)生。

靜態(tài)加載的成肌細(xì)胞改變肌腱細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)
 

肌腱分化是肌腱組成的一個(gè)重要方面。實(shí)驗(yàn)觀察到與肌腱細(xì)胞組相比，與無負(fù)荷成肌細(xì)胞組共培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞中的 Tnc mRNA 水平增加；與 24h 單獨(dú)培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞相比，S100a4、Scx 和 Vim 的 mRNA 水平在與未加載的成肌細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)顯示適度增加。Acta2 和 Mcam 無顯著變化。
 

與未加載的成肌細(xì)胞相比，在與靜態(tài)加載的成肌細(xì)胞共培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞中，所有三種肌腱細(xì)胞分化標(biāo)志物（Scx、Vim 和 Tnc）的表達(dá)均顯著降低。與未加載的成肌細(xì)胞相比，靜態(tài)加載的成肌細(xì)胞的分泌組在 24h 和 48h 增加了肌腱細(xì)胞中 S100a4 和 Acta2 的表達(dá)。
 

在與動(dòng)態(tài)加載的成肌細(xì)胞共培養(yǎng) 48h 后，肌腱細(xì)胞中 Scx 水平增加，Vim 表達(dá)降低，但 S100a4 和 Acta2 表達(dá)保持在對照水平。與動(dòng)態(tài)加載的成肌細(xì)胞共培養(yǎng) 24h 和 48h 后，Mcam 在肌腱細(xì)胞的表達(dá)無顯著變化。
 

這些結(jié)果表明動(dòng)態(tài)加載的成肌細(xì)胞的分泌組不會(huì)像靜態(tài)加載的成肌細(xì)胞那樣改變肌腱細(xì)胞的分化。
 

總之，這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究了機(jī)械負(fù)載成肌細(xì)胞的分泌組對體外肌腱細(xì)胞的影響。生物學(xué)終點(diǎn)包括遷移、增殖/凋亡、Col I/III 表達(dá)和細(xì)胞表型。靜態(tài)加載的成肌細(xì)胞的分泌組增強(qiáng)了細(xì)胞遷移，增加了 Col I/III 比率，并誘導(dǎo)了細(xì)胞特征的變化。這是首次研究成肌細(xì)胞分泌組對肌腱細(xì)胞的影響，以及可能的參與機(jī)制是否取決于體外成肌細(xì)胞的機(jī)械負(fù)荷類型。
 

參考文獻(xiàn)：Zhou X, Li J, Giannopoulos A, Kingham PJ, Backman LJ. Secretome from In Vitro Mechanically Loaded Myoblasts Induces Tenocyte Migration, Transition to a Fibroblastic Phenotype and Suppression of Collagen Production. Int J Mol Sci. 2021 Dec 3;22(23):13089. doi: 10.3390/ijms222313089. PMID: 34884895; PMCID: PMC8657858.
 

原文鏈接：https://pubmed-ncbi-nlm-nih-gov.proxy.library.carleton.ca/34884895/
 

圖片來源于參考文獻(xiàn)

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