IVA型粘多糖�。∕PSIVA）又名Morquio A病，是由N-乙酰氨基半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶（GALNS）缺乏引起的，導致硫酸角質(zhì)素（KS）和硫酸軟骨素-6-積累�；颊邥�出現(xiàn)嚴重的骨骼發(fā)育不良、早期軟骨退化以及危及生命的心臟和氣管并發(fā)癥，但目前尚無治愈方法。

基因治療作為一種新興的療法，通過AAV等遞送系統(tǒng)補償突變基因的效價，在眾多罕見病治療上展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。Bertolin等人在MPSIVA疾病模型中注射AAV9-Galns，發(fā)現(xiàn)GALNS的活性能長期（1年）恢復，并且KS的表達水平恢復正常，從而改善MPSIVA的癥狀。這項研究證明AAV9-Galns基因治療在治療MPSIVA的應(yīng)用潛力，為MPSIVA患者未來的臨床治療提供了強有力的理論基礎(chǔ)。

接下來我們就詳細解讀這篇文獻，再深入理解基因治療研究的常規(guī)套路吧。

研究思路

01 構(gòu)建MPSIVA大鼠疾病模型

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02 AAV9遞送系統(tǒng)的遞送效率檢測

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03 MPSIVA大鼠疾病模型的表型檢測與注射AAV9-Galns后的有效性評價

MPSIVA大鼠疾病模型的構(gòu)建

作者利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建含有錯義突變c.1156C>T的MPSIVA大鼠模型并且通過測序分析驗證了該點突變，GALNS點突變的產(chǎn)生導致GALNS蛋白的功能發(fā)生突變（p.Arg386Cys）。研究人員將雜合子大鼠（GALN^+/−）與野生型大鼠（GALN^+/+）回交，以消除CRISPR/Cas9相關(guān)的脫靶效應(yīng)（圖1a-c）。對GALN敲除大鼠進一步分析，發(fā)現(xiàn)在這些大鼠所有的組織中均無法檢測到GALNS活性水平，并且早在1個月大時，肝臟和血清中的KS含量一直很高，脛骨長度減少（圖1d-g）。
 

圖1.  MPSIVA大鼠疾病模型的構(gòu)建。

AAV9在骨骼系統(tǒng)中具有良好的遞送效果

由于MPSIVA疾病的基因治療面臨的主要挑戰(zhàn)是沒有良好的遞送系統(tǒng)，以增加局部GALNS的濃度。作者將AAV9-GFP注射至野生型雄性大鼠，通過觀察熒光強度來評價AAV9遞送系統(tǒng)的效率。在股骨、脛骨生長板（GP）和骨內(nèi)膜周圍的成骨細胞富集區(qū)、致密骨的內(nèi)部細胞和關(guān)節(jié)軟骨中檢測到GFP陽性信號（圖2a）。

此外，在所有大鼠骨骼（股骨、脛骨、前肢骨、胸骨、肋骨和椎骨）和Morquio A大鼠的關(guān)鍵外周器官中也發(fā)現(xiàn)了高水平的GFP表達（圖2b、c）。

然后對MPSIVA大鼠注射AAV9-Galns，載體基因組拷貝數(shù)分析表明，AAV9-Galns在骨骼（圖2d）和外周器官（圖2e）中有較好的轉(zhuǎn)導效率。表明AAV9在治療MPSIVA上具有很大的應(yīng)用潛力。

圖2. AAV9在骨骼系統(tǒng)中具有良好的遞送效果。

A. (I)致密骨(CB)； (II)生長板周圍區(qū)域(GP)；(III)關(guān)節(jié)；(IV)骨小梁；(V)骨內(nèi)膜。B. F，股骨；Ti，脛骨；R，肋骨；S，胸骨；V，椎骨；FL，前肢骨骼；K，膝蓋骨；Fi，腓骨；Sc，肩胛骨；Hu，肱骨；T，氣管；H，心臟；L，肝臟；A，附睪白色脂肪組織（eWAT）；Lu，肺；Q，股四頭肌。

注射AAV9-Galns能有效治療MPSIVA
身材矮小是MPSIVA患者的特點。MPSIVA雄性大鼠在第一個月齡期間顯示出與WT大鼠相似的體重，但隨后觀察到體重和體型的顯著下降（圖3a、b）。并且MPSIVA大鼠的壽命也顯著縮短，約30%的大鼠在2個月大時死亡（圖3c）。

經(jīng)過AAV9-Galns基因治療，MPSIVA大鼠的體重增加且存活率恢復正常（圖3a-c），并且GALNS的活性和KS的水平恢復正常（圖3d-f）。在肝臟和白色脂肪組織（WAT）中也發(fā)現(xiàn)GALNS活性較高（圖3g、h）。GALNS活性提高使肝臟中KS含量正�；�，僅儲存在Kupffer細胞和WAT中（圖3i-l）。此外，肝臟β-己糖胺酶（溶酶體內(nèi)穩(wěn)態(tài)生物標記物）活性恢復（圖3m）。
 

圖3. 注射AAV9-Galns能有效治療MPSIVA。

AAV9介導的Galns表達可防止骨骼病變
對MPSIVA大鼠使用AAV9-Galns，可增加Galns在骨骼中的表達，如股骨、脛骨和肱骨（圖4a），可以降低GP和骨干中的KS累積（圖4b-d）。

2個月大的MPSIVA大鼠的GP軟骨切片顯示GP面積和鈣化區(qū)均顯著減少，表明隨著大鼠年齡的增長，骨化發(fā)生了變化（圖4e）。對MPSIVA大鼠脛骨GP的分析顯示，靜止區(qū)和增殖區(qū)的軟骨細胞肥大，AAV9-Galns處理的MPSIVA大鼠的軟骨細胞肥大明顯減少（圖4f）。

透射電子顯微鏡（TEM）進一步證實了這一點，證明接受治療的動物增殖軟骨細胞中的儲存液泡大量減少（圖4g）。這些結(jié)果與AAV9-Galns基因治療的MPSIVA大鼠中觀察到的體型正�；�一致（圖3a、b）。

經(jīng)MPSIVA治療的大鼠顯示正常的骨密度和含量，以及小梁厚度、數(shù)量和間距。相反，未經(jīng)治療的MPSIVA大鼠的所有骨參數(shù)均發(fā)生改變（圖4h-j）。這些結(jié)果為這種基因療法治療MPSIVA病的骨病理學提供了強有力的證據(jù)。
 

圖4. AAV9介導的Galns表達可防止骨骼病變。

使用AAV9-Galns治療可防止牙齒異常改變
牙齒異常改變是MPSIVA患者的常見特征。在2個月大的MPSIVA大鼠中，牙齒錯牙合、脆性和釉質(zhì)發(fā)育不良已經(jīng)很明顯（圖5a）。相反，AAV9-Galns處理的MPSIVA大鼠門牙完整，咬合和釉質(zhì)正常（圖5a）。

通過下頜骨切片中門牙的LIMP2免疫染色顯示，產(chǎn)生釉質(zhì)的成釉細胞和乳頭層細胞中存在明顯的溶酶體擴張，導致釉質(zhì)發(fā)育不良（圖5a、b）。AAV9-Galns治療糾正了這些細胞的儲存病變（圖5b）。MPSIVA大鼠切牙的超微結(jié)構(gòu)分析顯示成釉細胞中有大量的儲存液泡。在使用AAV9-Galns基因治療后，病理性溶酶體積聚降低（圖5c）。
 

圖5. AAV9-Galns基因治療可防止牙齒異常改變。

AAV9-Galns基因治療關(guān)節(jié)軟骨病變
KS累積改變MPSIVA患者的關(guān)節(jié)軟骨，導致嚴重的骨關(guān)節(jié)炎，最終需要骨科手術(shù)。在4周齡的MPSIVA大鼠中，與WT大鼠相比，用藏紅O染色和LIMP2免疫染色對脛骨軟骨切片的分析發(fā)現(xiàn)軟骨細胞肥大增加（圖6a-c）。在8周齡時，在MPSIVA大鼠的關(guān)節(jié)軟骨切片中觀察到LIMP2信號加劇，這與進行性KS積聚和溶酶體擴張一致（圖6d、e）。對MPSIVA大鼠注射AAV9-Galns，可顯著糾正關(guān)節(jié)軟骨中的儲存病變（圖6d、e）。并且在治療后，死亡率顯著降低（圖6f）。

對6個月大的MPSIVA大鼠肱骨軟骨切片進行組織學分析，并用藏紅O染色，發(fā)現(xiàn)存在骨關(guān)節(jié)炎，在關(guān)節(jié)軟骨最淺層有大量肥大軟骨細胞（圖6g）。注射AAV9-Galns能夠減少該層中肥大軟骨細胞的數(shù)量（圖6g）。脛骨關(guān)節(jié)軟骨表層軟骨細胞的超微結(jié)構(gòu)分析顯示，與未經(jīng)治療的動物相比，AAV9-Galns基因治療的MPSIVA大鼠減少了儲存囊泡（圖6h）。

對MPSIVA大鼠給藥11個月后，發(fā)現(xiàn)軟骨細胞肥大程度減少，并防止了膝關(guān)節(jié)軟骨丟失（圖6j、k）。這與注射AAV9-Galns的大鼠關(guān)節(jié)軟骨中基質(zhì)金屬蛋白酶表達的正常化一致，有助于骨關(guān)節(jié)炎的預(yù)防（圖6l）。此外，在滑膜中觀察到的溶酶體擴張在AAV9-Galns治療后正�；�（圖6m）。與關(guān)節(jié)改變一致，MPSIVA大鼠在2個月大時已經(jīng)表現(xiàn)出握力下降（圖6i）。AAV9-Galns基因治療的MPSIVA大鼠表現(xiàn)出與WT大鼠相似的行為（圖6i），這表明AAV9-Galns基因治療可改善MPSIVA的骨關(guān)節(jié)炎病變。

圖6. AAV9-Galns基因治療關(guān)節(jié)軟骨病變。

AAV9-Galns治療氣管和心臟病
在MPSIVA患者中觀察到的最嚴重的非骨骼表現(xiàn)是呼吸和心血管并發(fā)癥，這也是致死的主要原因。在MPSIVA大鼠中觀察到氣管透明軟骨、呼吸上皮和固有層的改變。AAV9-Galns基因治療提高氣管和肺中的Galns表達和活性，修正軟骨細胞、睫狀體細胞和成纖維細胞的儲存異常（圖7a-f），逆轉(zhuǎn)MPSIVA患者呼吸道的病變。

同樣，在注射AAV9-Galns后，MPSIVA大鼠心臟中觀察到高水平的Galns表達和活性（圖7g）。然而，Morquio患者的主要心臟異常是瓣膜。TEM分析顯示MPSIVA大鼠二尖瓣的儲存異常（圖7h），而AAV9-Galns可以修正二尖瓣細胞的儲存異常（圖7h）。

此外，在MPSIVA大鼠的LIMP2免疫染色，還觀察到主動脈壁切片平滑肌纖維的溶酶體擴張，而在AAV9-Galns處理的MPSIVA大鼠中正�；�。AAV9-Galns處理的MPSIVA大鼠主動脈纖維的超微結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)沒有液泡，說明儲存異常得到修正（圖7i）。

MPSIVA大鼠的瓣膜功能障礙和主動脈壁改變可能導致心率增加（圖7j），患者的心率也會改變。而用AAV9- Galnsa基因治療MPSIVA大鼠也能使心率正�；�（圖7j）。
 

圖7. AAV9-Galns治療氣管和心臟病。

小結(jié)
Galns表達和活性的降低會引發(fā)骨骼病變和危及生命的心臟和氣管并發(fā)癥，作者通過AAV9遞送系統(tǒng)，使Galns缺陷的MPSIVA大鼠過表達Galns，有顯著的治療效果。

作者以清晰的研究思路和扎實的實驗數(shù)據(jù)，證明了AAV9-Galns基因治療在MPSIVA疾病的治療作用。這個過程包括了動物模型構(gòu)建、AAV9遞送系統(tǒng)效率的驗證、疾病表型檢測和治療后有效性評價，這也是基因治療研究的常規(guī)套路。

參考文獻：
Bertolin J, Sánchez V, Ribera A, et al. Treatment of skeletal and non-skeletal alterations of Mucopolysaccharidosis type IVA by AAV-mediated gene therapy. Nat Commun. 2021;12(1):5343. Published 2021 Sep 9. doi:10.1038/s41467-021-25697-y.