本文要點：由多重耐藥細菌而引起的感染對人類健康仍然可以造成巨大威脅。因此我們需要探索更有效的抗菌替代策略。本研究開發(fā)了一種具有粗糙表面的碳-鐵氧化物納米復(fù)合物(RCF)，可用于近紅外二區(qū)光協(xié)同抗菌治療。RCF具有良好的光熱特性和過氧化物酶樣活性，可在NIR-II窗口下實現(xiàn)光熱/動力協(xié)同治療(PTT)。此外，表面粗糙的RCF可以增加細菌對其的粘附，更有利于協(xié)同抗菌作用。體外抗菌實驗表明，RCF對革蘭氏陰性大腸桿菌、革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌均具可以產(chǎn)生殺傷作用。在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染大鼠的實驗?zāi)Ｐ椭�，RCF可以清除感染菌，同時具有良好的生物相容性。本研究合成的抗菌藥物RCF在治療耐藥細菌感染方面具有巨大潛力。
 

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如圖1所示，RCF可以催化低濃度的H2O2生成羥基。在低功率密度(0.5 W/cm2)的NIR-II窗口下，碳納米殼還可以產(chǎn)生光熱效應(yīng)，因此復(fù)合物RCF具有協(xié)同抗菌能力。
 

圖1：RCF納米復(fù)合物的制備及其協(xié)同抗菌治療的示意圖。

 

首先，作者合成了碳納米殼，平均直徑為180 ± 20 nm（圖2 a）。然后將其與Fe3O4納米粒進行組裝，組裝后RCF表面變得粗糙，平均直徑為190 ± 20 nm （圖2 b-c）。接下來，作者驗證了RCF的催化活性和光熱性能。在測定其催化活性的實驗中，當H2O2(10 mM)和TMB (1 mM)均存在時，RCF在652 nm處出現(xiàn)最強的吸收峰，這說明RCF具有類似過氧化物酶的性能，能夠觸發(fā)TMB的氧化，且這種催化活性與RCF濃度呈正相關(guān)（圖2 g-h）。在測定其光熱性能的實驗中，作者用1064 nm波長激光照射RCF水溶液并記錄下來其溫度變化，發(fā)現(xiàn)不同濃度的RCF溶液的溫度隨著激光的照射均呈上升趨勢，且也與濃度呈正相關(guān)（圖2 i）。因此，RCF具有催化生成羥基和產(chǎn)生光熱效應(yīng)的特性，在抗感染治療中具有很大的潛力。
 

圖2： (a) RC， (b) RCF， (d) SC和(e) SCF納米顆粒的TEM圖像。 (c) RCF和(f) SCF納米顆粒的SEM圖片。 比例尺:200nm。 (g)不同處理TMB溶液(1 mM)的紫外-可見吸收光譜。 (h) 不同RCF濃度處理的TMB溶液的紫外-可見吸收光譜。 (i)不同濃度RCF溶液經(jīng)近紅外激光后的光熱曲線(1064 nm, 0.5 W/cm2，5 min)。

 

接下來，作者驗證了RCF的體外抗菌效果。作者選取了大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為參照菌，通過平板計數(shù)法，作者發(fā)現(xiàn)，當不添加H2O2同時也不加近紅外二區(qū)光照時，RCF不能產(chǎn)生殺菌作用。當 添加H2O2后，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的數(shù)量均有明顯下降，下降趨勢與RCF濃度的升高呈正比。當加上近紅外二區(qū)激光后，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的數(shù)量也會明顯下降，但無論是單獨添加H2O2還是單獨加近紅外二區(qū)激光，其抗菌效果均不理想。但兩個條件同時存在時，RCF均有良好的抗菌效力（圖3a-d）。通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)，當環(huán)境中同時存在RCF、H2O2和近紅外二區(qū)激光存在時，RCF可以破壞大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的細菌結(jié)構(gòu)，對其造成殺傷（圖3e）。作者還發(fā)現(xiàn)RCF也可以對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌產(chǎn)生殺傷作用，最低抑菌濃度為256 μg/mL （圖3f-g）。這些結(jié)果驗證了RCF的高效協(xié)同抗菌作用。

 

圖3：經(jīng)近紅外激光照射和H2O2處理的(a)大腸桿菌(b)金黃色葡萄球菌和(f)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的菌落。用平板計數(shù)法測定各組經(jīng)RCF處理后大腸桿菌(c)、金黃色葡萄球菌(d)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (g)的細菌存活率。(e)不同處理后大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的SEM圖像:(I) PBS， (II) H2O2， (III) NIR， (IV) H2O2+ NIR， (V) RCF， (VI) RCF + H2O2， (VII) RCF + NIR， (VIII) RCF + H2O2+ NIR。比例尺:1 μm。

 

此外，作者還通過熒光染料STYO-9和PI分別染色活細菌和死細菌來驗證RCF的殺菌效力。得到的結(jié)果與平板計數(shù)法的結(jié)果一致，表明RCF在協(xié)同抗菌治療中具有巨大潛力（圖4a-b）。
 

圖4： (a)大腸桿菌和(b)金黃色葡萄球菌經(jīng)PBS、(II) H2O2、(III) NIR、(IV) H2O2+ NIR、(V) RCF (512 μg/mL)、(VI) RCF + H2O2、(VII) RCF + NIR、(VIII) RCF + H2O2+ NIR處理后的熒光圖像。 紅色和綠色熒光分別代表死菌和活菌。比例尺: 25μm。

 

接下來，作者通過細胞毒性實驗和溶血性實驗探究了RCF的生物相容性。通過MTT法測定RCF在達到512 μg/mL時，L929細胞存活率仍大于80%（圖5 a）。用PBS將RCF溶液稀釋到不同濃度，分別與紅細胞共孵育，各組均未發(fā)生溶血現(xiàn)象，表明其具有良好的生物相容性（圖5 b）。在大鼠皮膚創(chuàng)面區(qū)域，照射1064 nm的激光（0.5 W/cm2）,在照射5 min后，創(chuàng)面區(qū)域溫度從26.1℃迅速上升到60.4℃，證明RCF具有在體內(nèi)PTT效應(yīng)的可行性（圖5 c-d）。
 

圖5：(a)經(jīng)不同濃度RCF溶液處理后L929細胞的細胞活力。 (b)不同濃度RCF溶液的相對溶血比。 (c) 256 μg RCF處理大鼠皮膚創(chuàng)傷后，在1064 nm, 0.5 W/cm2近紅外激光照射5 min的熱圖像和溫度變化曲線。

 

于是，作者為了驗證RCF的體內(nèi)清除感染菌的能力，選用了大鼠皮膚感染耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的動物模型。將同品系大鼠隨機分為五組，Ⅰ.PBS組；Ⅱ.RCF組；Ⅲ.RCF + H2O2組；Ⅳ.RCF +NIR-II激光；Ⅴ.RCF + H2O2 + NIR-II激光。分別在處理后第1，3，5，7天對傷口進行圖像采集（圖6 a）。第7天時，對各組感染區(qū)域的組織載菌量和感染面積進行測定，并送去做組織切片，Ⅴ組結(jié)果與其他組相比有顯著差異（圖6 c-e）。綜上，RCF具有良好的殺菌性能，有望用于抗菌感染和促進創(chuàng)面愈合。

 

圖6：(a)在第0、1、3、5、7天采集不同處理組的感染傷口圖像(I) PBS， (II) RCF， (III) RCF + H2O2， (IV) RCF + NIR， (V) RCF + H2O2+ NIR。(c)不同處理組的感染組織載菌量測定分析。 (d) 7 d后各治療組的感染傷口面積。 (e) 7天后不同治療組感染傷口組織的H&E染色圖像。

 

結(jié)論：本研究成功構(gòu)建了一種表面粗糙的碳鐵氧化物納米復(fù)合物來用于協(xié)同抗菌。碳納米殼具有光熱特性，同時氧化鐵納米粒具有類過氧化物酶催化活性，可以在NIR-II激光(1064 nm, 0.5 W/cm2)照射下，實現(xiàn)PTT/CDT的協(xié)同作用。此外，其具有良好的生物相容性和較低的毒性，為構(gòu)建具有實際意義的高效抗菌新方法提供了一種簡便的策略。

 

參考文獻

Liu Z, ZhaoX, Yu B, Zhao N, Zhang C, Xu FJ. Rough Carbon-Iron Oxide Nanohybrids forNear-Infrared-II Light-Responsive Synergistic Antibacterial Therapy. ACSNano. 2021 Apr 27;15(4):7482-7490.

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