文章標(biāo)題：He-Chan Pian inhibits the metastasis of non-small cell lung cancer via the miR-205-5p-mediated regulation of the GREM1/Rap1 signaling pathway

發(fā)表期刊：Phytomedicine
發(fā)表時(shí)間：2021.10.24
影響因子：5.340
合作客戶：廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院
百趣生物提供服務(wù)：中藥非靶（UPLC-MS）
分組情況：模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、HCP[L]組、HCP[M]組、HCP[H]組
分析圖：總離子流圖、成分鑒定表

研究背景

非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是危害最大的惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高。NSCLC的治療方式主要包括手術(shù)切除、化療、放療、靶向治療和免疫治療。

近年來(lái)中醫(yī)藥（TCM）越來(lái)越多地用作肺癌的輔助治療。研究表明，GREM1在腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，HCP也顯示出對(duì)肺癌患者的巨大臨床益處。但是相關(guān)的抗腫瘤作用的分子機(jī)制尚未得到很好的表征。本研究致力評(píng)估HCP的作用和GREM1在NSCLC轉(zhuǎn)移中的作用。

研究?jī)?nèi)容

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
向40只裸鼠體內(nèi)注射A549細(xì)胞建立腫瘤模型，成功后將裸鼠分為5組：模型組、HCP（L）組、HCP（M）組、HCP(H)組和陽(yáng)性對(duì)照組（DDP）。之后分別對(duì)各組裸鼠進(jìn)行不同方式不同劑量的給藥培養(yǎng)，持續(xù)給藥21天

血清中HCP的分析
從處理過(guò)的裸鼠血清中鑒定出 36種HCP的主要成分/代謝物，36種主要成分和代謝產(chǎn)物中有10個(gè)單體具有抗腫瘤功能：毛豆素、肉豆蔻酸、 picein、resistogenin、14-脫氧穿心蓮內(nèi)酯、celastrol 、脫氫樅酸、肉桂酸、芹菜素-7 - O-葡萄糖苷和棕櫚酸。這些發(fā)現(xiàn)提供了對(duì) HCP 抗腫瘤作用因素的深入了解
 

圖1 血清中36種HCP組分的TIC圖（A）為空白血清,（B）為含HCP血清

HCP在體外抑制肺癌腫瘤生長(zhǎng)，無(wú)肝腎毒性
在第7天，HCP (M)、HCP (H) 和DDP 組的腫瘤體積較低（圖2A ）。在第14天，HCP（M）和HCP（H）組的腫瘤體積顯著低于其他組，并且隨著劑量的增加，腫瘤體積有減小的趨勢(shì)（圖2B）。在第21天，HCP (H) 組的腫瘤重量和體積顯著下降（圖2C、D）。在治療的21天期間，所有組的體重都有增加的趨勢(shì)（圖2E）。治療21天后，HCP（H）組的體重變化明顯低于對(duì)照組（圖2F）。HCP（L）、HCP（M）、HCP（H）和DDP組在治療后腫瘤抑制率（IRs）分別為6.51%、14.58%、29.38%和36.40%。治療21天后，各組之間的肝臟或腎臟指標(biāo)沒有顯著差異（圖2G、H）。

解剖過(guò)程順利，腫瘤可完全分離�？梢郧宄�地區(qū)分腫瘤組織和周圍組織。腫瘤質(zhì)地較硬，邊界清晰。模型組的體積高于其他組。切片并用H＆E染色后，癌細(xì)胞大且異形，細(xì)胞核大且染色強(qiáng)烈。模型組腫瘤細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核多，形態(tài)清晰。DDP組腫瘤細(xì)胞分布較松散，細(xì)胞相對(duì)較少。與模型組相比，HCP處理組異常細(xì)胞相對(duì)較少，細(xì)胞密度較松散（圖2I）。觀察各組肝組織切片。每組小鼠的肝小葉是完整的，肝細(xì)胞沒有放大，細(xì)胞核定位在中間，細(xì)胞間隙清楚，而且沒有明顯的異常（圖2J）。各組腎組織切片未見明顯病理改變。腎小球中發(fā)生病變的膜細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞沒有增加（圖2K）。
 

圖2 HCP體外抑制肺癌腫瘤生長(zhǎng)，對(duì)肝、腎無(wú)毒性作用。(A)(B)(C)(D)為不同時(shí)間腫瘤體積/重量圖，(E)(F)(G)(H)為重量變化圖，(I)(J)(K)為組織切片染色圖

HCP 抑制 EMT、GREM1 水平和相關(guān)通路
Western印跡表明HCP（H）組波形蛋白和N-鈣粘蛋白水平顯著低于模型組。HCP (M)、HCP (H) 和DDP組的蝸牛水平顯著降低。HCP（H）和DDP組的E-鈣粘蛋白水平增加（圖3A、B）。蛋白質(zhì)芯片數(shù)據(jù)表明 14 種蛋白質(zhì)表現(xiàn)出差異表達(dá)（4 種下調(diào)和10種上調(diào)）（圖3C）。上調(diào)的蛋白質(zhì)之一是GREM1，它由GREM1基因編碼，與癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。高通量測(cè)序揭示了1121個(gè)差異表達(dá)的基因（441個(gè)下調(diào)和680個(gè)上調(diào)）（圖3D）。Rap1 信號(hào)通路表明，GREM1表達(dá)受 miR-205-5p 調(diào)節(jié)（圖3E）。因此，HCP通過(guò)調(diào)節(jié)Rap1信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤作用，GREM1是NSCLC轉(zhuǎn)移的重要治療靶點(diǎn)。
 

圖3 HCP可抑制EMT、GREM1表達(dá)及相關(guān)通路(A)(B)為蛋白水平結(jié)果，(C)(D)為層次聚類熱力圖，(E)為通路圖

GREM1通過(guò)調(diào)節(jié)EMT和Rap1通路促進(jìn)轉(zhuǎn)移
使用CCK-8測(cè)定評(píng)估GREM1對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響。A549細(xì)胞中的OE-GREM1沒有顯著抑制或促進(jìn)增殖（圖4A）。用shGREM1轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞時(shí)，觀察到相同的結(jié)果（圖 5A）。使用傷口愈合和Transwell測(cè)定探索了GREM1對(duì)轉(zhuǎn)移的影響。OE-GREM1顯著增加了A549細(xì)胞的遷移和侵襲（圖4B、C）。當(dāng)用shGREM1轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞時(shí)，遷移和侵襲顯著減少（圖5B 、C）。這些數(shù)據(jù)證實(shí)GREM1促進(jìn)了NSCLC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，并沒有顯著增加細(xì)胞增殖。

為了進(jìn)一步探索GREM1對(duì)轉(zhuǎn)移影響的潛在機(jī)制，作者研究了其在EMT中的作用。隨著GREM1表達(dá)的增加，間充質(zhì)標(biāo)志物（包括波形蛋白、Snail 和N-鈣粘蛋白）的蛋白質(zhì)水平顯著增加。相比之下，上皮標(biāo)志物E-鈣粘蛋白的水平急劇下降（圖4D）。在用shGREM1處理的A549細(xì)胞中，間充質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)被抑制，上皮標(biāo)志物的表達(dá)顯著增加（圖5D）。因此，GREM1可能通過(guò)促進(jìn)EMT進(jìn)展來(lái)促進(jìn)NSCLC的遷移和侵襲。作者進(jìn)一步研究了Rap1相關(guān)信號(hào)通路組分（Rap1、c-raf 和 erk1/2）在NSCLC中響應(yīng)GREM1的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GREM1過(guò)表達(dá)顯著增加了Rap1通路中信號(hào)蛋白相關(guān)基因的表達(dá)（圖4D），反之亦然（圖5D）。因此，這些結(jié)果表明GREM1在Rap1通路的調(diào)節(jié)中起重要作用，并可能通過(guò)激活該通路促進(jìn)NSCLC的轉(zhuǎn)移。
 

圖4 OE-GREM1通過(guò)Rap1途徑調(diào)節(jié)EMT進(jìn)展，促進(jìn)A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移

圖5 ShGREM1通過(guò)Rap1通路調(diào)節(jié)EMT進(jìn)展來(lái)影響A549細(xì)胞的轉(zhuǎn)移

GREM1不促進(jìn)A549異種移植小鼠模型的增殖
為了檢查GREM1在體內(nèi)A549細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用，作者使用裸鼠進(jìn)行異種移植腫瘤測(cè)定（圖6A-B）。OE-GREM1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞小鼠的體重與其他組沒有顯著差異（圖6C ）。然而，在第42、46和48天，HCP治療的OE-GREM1組的腫瘤體積和腫瘤生長(zhǎng)低于其他組。在第48天，該組的腫瘤體積和重量顯著低于對(duì)照組（圖6D、E）。這些數(shù)據(jù)表明GREM1不促進(jìn)體內(nèi)A549細(xì)胞生長(zhǎng)。

MiR-205-5P直接調(diào)節(jié)GREM1表達(dá)
為了驗(yàn)證miR-205-5P是否與GREM1相互作用并抑制其表達(dá)，作者構(gòu)建了表達(dá) WT和突變體GREM1的質(zhì)粒。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)用于確定GREM1表達(dá)。與 miR-205-5p模擬物共轉(zhuǎn)染的GREM1的熒光比率顯著降低（圖6F、G）。這些發(fā)現(xiàn)表明GREM1促進(jìn)NSCLC轉(zhuǎn)移，其表達(dá)受到miR-205-5P的負(fù)調(diào)控。
 

圖6 OE-GREM1不影響A549異種移植裸鼠模型的增殖，而miR-205-5P直接調(diào)控GREM1的表達(dá)

結(jié) 論

從HCP處理的小鼠血清中分類出36種成分。HCP可以在一定程度上減緩裸鼠皮下移植腫瘤的生長(zhǎng)速度。HCP對(duì)肺癌小鼠模型的肝臟和腎臟沒有影響，沒有觀察到副作用。HCP的作用方式可能與其通過(guò)miR-205-5p調(diào)控的Gremlin/Rap1信號(hào)通路抑制NSCLC轉(zhuǎn)移有關(guān)。

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