文章標(biāo)題：Extracellular DNA released by glycine-auxotrophic Staphylococcus epidermidis small colony variant facilitates catheter-related infections

發(fā)表期刊：Communications Biology
發(fā)表時(shí)間：2021年4月
影響因子：6.268
合作客戶：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院
 

  研究背景

小菌落突變株(SCV)是一種具有獨(dú)特表型及致病特征且生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌亞群，目前已發(fā)現(xiàn)SCV與植入性相關(guān)的葡萄球菌感染有著明確聯(lián)系。由于長(zhǎng)期以來(lái)導(dǎo)管和許多其他類型的植入性醫(yī)療器械引起的感染，被認(rèn)為是危及生命的醫(yī)院膿毒癥的主要來(lái)源，目前迫切需要闡明SCV在導(dǎo)管相關(guān)感染發(fā)生中的作用機(jī)制。

本課題使用基因組學(xué)和代謝組學(xué)等技術(shù)，通過(guò)對(duì)臨床典型的表皮葡萄球菌病例分析（包括穩(wěn)定型SCV、正常表皮葡萄球菌NC和不穩(wěn)定型SCV），研究SCV在導(dǎo)管感染中的潛在機(jī)制，以及分析生物膜的形成和甘氨酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、肽聚糖連接率的影響。

研究結(jié)果表明，表皮葡萄球菌穩(wěn)定型SCV的突變影響到了各種代謝過(guò)程。由于能夠快速自溶并且釋放eDNA，SCV表現(xiàn)出更強(qiáng)的生物膜形成能力。當(dāng)SCV與NC共同感染時(shí)，SCV可以促進(jìn)NC的體外生物膜形成和體內(nèi)存活。本課題為甘氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型表皮葡萄球菌SCV在持續(xù)性感染中的作用提供了新的思路。

 

研究結(jié)果 

1.在表皮葡萄球菌為主的導(dǎo)管感染中SCV呈現(xiàn)高流行率
在128例導(dǎo)管感染病例中，葡萄球菌占總病例的39.1%，其中表皮葡萄球菌占比最為突出，而革蘭氏陰性桿菌、棒狀桿菌和腸球菌分別僅占18.0%、4.7%和3.9% (圖1a)。21.9%的導(dǎo)管感染是由多物種共同感染，且多數(shù)是和表皮葡萄球菌相關(guān)（14/28,50%），這進(jìn)一步證明了表皮葡萄球菌在導(dǎo)管感染中起到重要作用(圖1a)。

在同一葡萄球菌感染病例中，SCV通常伴隨著正常型NC一同出現(xiàn)(41/50,82%)（圖1b）。然而大多數(shù)SCV的表型并不穩(wěn)定，在傳代培養(yǎng)后很容易恢復(fù)成正常大小的菌落（Rev）。因此50個(gè)案例中只有8個(gè)是穩(wěn)定型的SCV。
 

圖1. 從臨床病例中收集SCV

2.表皮葡萄球菌穩(wěn)定型SCV具有更強(qiáng)的生物膜形成能力
表型分析顯示，穩(wěn)定型SCV的生物膜形成能力比NC更強(qiáng)（圖2a）。此外，在穩(wěn)定型SCV中也觀察到了侵入人類A549細(xì)胞和附著于非生物聚苯乙烯表面的能力（圖2b、c），而表皮葡萄球菌 Rev表現(xiàn)出與NC相同的表型。由于細(xì)菌附著能力與其理化性質(zhì)密切相關(guān)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定型SCV的zeta電位比NC更偏陽(yáng)性。因此穩(wěn)定型SCV的附著能力增加可能是細(xì)菌和帶負(fù)電荷的基質(zhì)之間排斥力降低所致。
 

圖2. 表皮葡萄球菌穩(wěn)定型 SCV的表型改變

3.表皮葡萄球菌穩(wěn)定型SCV的基因突變和相關(guān)代謝紊亂涉及到了廣泛的細(xì)胞代謝過(guò)程
全基因組測(cè)序覆蓋了表皮葡萄球菌126個(gè)基因，其中61個(gè)基因是穩(wěn)定型SCV獨(dú)有的， NC和Rev只有細(xì)微的差異（圖3a）。KEGG通路分析結(jié)果注釋到了廣泛的關(guān)鍵代謝過(guò)程，從丙酮酸代謝、檸檬酸循環(huán)到嘧啶代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝（圖3b）。此外，存在多個(gè)與生物素合成、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成以及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝相關(guān)的基因，進(jìn)一步暗示穩(wěn)定型 SCV 中的代謝途徑可能會(huì)受到這些突變的干擾。

代謝分析的PCA結(jié)果表明（圖 3c），表皮葡萄球菌NC和穩(wěn)定型SCV兩組明顯分開(kāi)，表明穩(wěn)定型SCV的代謝水平上發(fā)生了顯著變化。篩選出的39種差異代謝物（DEM）中，28種在表皮葡萄球菌穩(wěn)定SCV中上調(diào)，11種下調(diào)（圖3d），其中氨基酸及其衍生物占大部分（16/39，41%），其次是核苷酸及其類似物（9/39，23%）。而葡萄球菌細(xì)胞壁五肽交聯(lián)橋的主要成分甘氨酸的含量顯著降低，此外丙酮酸和乙酰輔酶A的含量也顯著上調(diào)。

STITCH的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)證明移碼突變有可能對(duì)相關(guān)代謝物產(chǎn)生巨大影響。在圖中（圖3e），甘氨酸的濃度異常降低而大多數(shù)DEM的濃度增加，與移碼 SERP1287基因相互關(guān)聯(lián)，其產(chǎn)物是催化甘氨酸合成的丙氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AGXT1）。此外，該網(wǎng)絡(luò)還暗示乙酰輔酶A水平的急劇增加可能歸因于odhA和accA的突變（圖3e），這兩者都催化了乙酰輔酶A的下游分解反應(yīng)。由于乙酰輔酶A對(duì)丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的抑制作用，丙酮酸可能因此積累。
 

圖3. 表皮葡萄球菌穩(wěn)定型 SCV 的基因組學(xué)分析和代謝組學(xué)分析

4.功能失調(diào)的甘氨酸生物合成是導(dǎo)致表皮葡萄球菌穩(wěn)定型SCV生長(zhǎng)緩慢的原因
基因組學(xué)和代謝組學(xué)分析表明，表皮葡萄球菌穩(wěn)定SCV的緩慢生長(zhǎng)可能是由于甘氨酸短缺造成的。在革蘭氏陽(yáng)性葡萄球菌中，甘氨酸也是肽聚糖交聯(lián)橋的組成部分，其缺乏會(huì)阻止肽聚糖交聯(lián)，從而降低細(xì)胞壁的構(gòu)建速度。

在培養(yǎng)基中添加外源甘氨酸能夠使穩(wěn)定型SCV生長(zhǎng)明顯改善，接近正常表皮葡萄球菌NC，而甘氨酸對(duì)NC生長(zhǎng)的影響很�。▓D4a），這表明分離到的SCV是甘氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型SCV。通過(guò)帶有TAMRA 的熒光標(biāo)記的D-氨基酸 (FDAA) 來(lái)確定表皮葡萄球菌NC和穩(wěn)定型SCV的肽聚糖連接率，結(jié)果表明在相同的標(biāo)記時(shí)間（30 分鐘）內(nèi)，穩(wěn)定型SCV產(chǎn)生的TAMRA信號(hào)比NC顯著減少，說(shuō)明了其肽聚糖連接速率要慢得多（圖4b）。

補(bǔ)充甘氨酸可以將TAMRA 信號(hào)恢復(fù)到與NC 相同的水平，但對(duì)NC沒(méi)有影響，表明甘氨酸短缺確實(shí)通過(guò)降低肽聚糖連接率對(duì)穩(wěn)定型SCV生長(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)面影響。
 

圖4. 外源性甘氨酸對(duì)表皮葡萄球菌穩(wěn)定型SCV生長(zhǎng)和肽聚糖連接率的影響

5.表皮葡萄球菌穩(wěn)定型SCV釋放的細(xì)胞外DNA(eDNA)能夠促進(jìn)生物膜的形成
使用共聚焦激光掃描顯微鏡成像觀察生物膜含量（圖5a），SCV具有顯著更高的生物膜生物量和平均生物膜厚度（圖5b）。通過(guò)從穩(wěn)定型SCV形成生物膜中提取eDNA進(jìn)行半定量分析，進(jìn)一步證實(shí)了穩(wěn)定型SCV可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)DNA的釋放來(lái)影響生物膜基質(zhì)的組成，尤其是高分子量eDNA（圖5c）。然而如 Alexa Fluor 350 偶聯(lián)小麥胚芽凝集素 (WGA) 和半定量的熒光信號(hào)所反映的，表皮葡萄球菌的主要生物膜基質(zhì)PIA沒(méi)有顯著變化（圖5d)。

此外，穩(wěn)定型SCV與 NC在蛋白酶 K 處理后的生物膜生物量下降相似，而在用 DNase I 處理后，穩(wěn)定型SCV的生物膜生物量下降幅度顯著大于NC（圖5e），進(jìn)一步說(shuō)明eDNA 釋放直接增強(qiáng)了表皮葡萄球菌穩(wěn)定型SCV的生物膜形成。
 

圖5. 細(xì)胞外 DNA (eDNA) 釋放的增加促進(jìn)了表皮葡萄球菌穩(wěn)定 SCV 的生物膜形成
 

6.穩(wěn)定型SCV可促進(jìn)導(dǎo)管相關(guān)感染的物種共同生存
盡管細(xì)胞活力下降，表皮葡萄球菌穩(wěn)定型SCV能夠提供生存優(yōu)勢(shì)，使整個(gè)群體受益。在初始接種劑量下，穩(wěn)定的SCV對(duì)體外NC生物膜形成的影響相當(dāng)顯著（圖 6a）。當(dāng)穩(wěn)定型SCV 和 NC 在小鼠導(dǎo)管感染模型中共感染時(shí)，從植入的導(dǎo)管和周圍組織中回收的細(xì)菌 CFU 顯著高于穩(wěn)定型SCV 或NC獨(dú)立感染時(shí)的數(shù)量（圖 6b）。
 

圖6.表皮葡萄球菌穩(wěn)定型 SCV 亞群的有益作用

 結(jié) 論

生物膜的形成是導(dǎo)管感染以及許多其他類型的異物感染的發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵過(guò)程，本文研究了甘氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型表皮葡萄球菌穩(wěn)定型SCV感染的機(jī)制，說(shuō)明了感染過(guò)程中伴隨著基因組變異和代謝功能障礙。而且穩(wěn)定型SCV和NC可以協(xié)同作用，促進(jìn)生物膜相關(guān)導(dǎo)管感染的發(fā)生和持續(xù)存在。盡管如此，臨床表皮葡萄球菌SCV的突變和代謝譜的復(fù)雜性以及病理機(jī)制的多樣性表明，表皮葡萄球菌SCV仍需要更深入的研究。

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