*盡管 NextSeq 2000系統(tǒng)的通量高于 NextSeq 1000系統(tǒng)，但兩者的性能和數(shù)據(jù)質(zhì)量不相上下。因此，本應(yīng)用說明中僅選用NextSeq 2000系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)比較研究。

使用DRAGEN™ Enrichment Pipeline v3.4進行二級數(shù)據(jù)分析，它可在NextSeq 2000系統(tǒng)上運行或通過BaseSpace™ Sequence Hub運行。根據(jù) Platinum Genomes 2016 v1.0數(shù)據(jù)集評估變異檢出的準確性⁴。

群體細胞mRNA測序
使用TruSeq™ Stranded mRNA Library Prep Kit（Illumina，貨號20020594）從通用人類參比 RNA（Coriell 醫(yī)學(xué)研究所）樣本中制備信使RNA（mRNA）文庫。

使用NextSeq 1000/2000 P2 Reagent Kit（200 個循環(huán)）在NextSeq 2000系統(tǒng)上對其測序，運行配置為 2×76bp。為了進行比較，使用NextSeq 500/550 High-Output Kit v2.5（300 個循環(huán)）在 NextSeq 550系統(tǒng)上對相同文庫進行測序，運行配置為 2×76 bp。每臺儀器在單次運行中可對24個樣本進行多重測序。

使用DRAGEN RNA Pipeline v3.5.112進行二級數(shù)據(jù)分析，它可在NextSeq 2000系統(tǒng)或BaseSpace Sequence Hub上運行。數(shù)據(jù)與基因組參照序列聯(lián)盟的人類標(biāo)準基因GRCh38（組裝 h38）進行比對。

單細胞RNA測序
單細胞RNA測序（scRNA-Seq）的樣本是用4重外周血單核細胞（PBMC）制備的，后者從單個供體的全血中分離而來。使用Chromium Single Cell Gene Expression v3 Solution（10x Genomics，貨號1000092）在Chromium Controller（10x Genomics，貨號 120223）上從約1000個PBMC中制備文庫。

使用NextSeq 1000/2000 P2 Reagent Kit（200 個循環(huán)）在NextSeq2000系統(tǒng)上對其測序。為了進行比較，使用NextSeq 500/550 High-Output Kit v2.5（150 個循環(huán)）（Illumina，貨號20024907）在NextSeq 550系統(tǒng)上對相同文庫進行測序。根據(jù)10x Genomics提供的參數(shù)設(shè)置運行配置：read 1 28個循環(huán)，index read 8個循環(huán)，read 2 91個循環(huán)。

使用Cell Ranger scRNA-Seq分析流程（10x Genomics公司）進行數(shù)據(jù)分析，以比對read、成簇和分析基因表達。

結(jié)果/Results
外顯子組測序
評估包括單核苷酸位點變異（SNV）和插入 / 缺失（indel）的查準率和查全率、運行輸出數(shù)據(jù)量（產(chǎn)量）、錯誤率、匹配read百分比、平均靶點覆蓋深度和覆蓋度均一性在內(nèi)的初級和二級分析指標(biāo)。NextSeq 550和NextSeq 2000系統(tǒng)在測序數(shù)據(jù)輸出量和數(shù)據(jù)質(zhì)量方面都超過了公布的技術(shù)規(guī)范，兩個測序平臺都保有出色的測序性能（表1）。這些數(shù)據(jù)表明，NextSeq 2000系統(tǒng)和 NextSeq 550系統(tǒng)的外顯子組測序結(jié)果不相上下，兩個平臺都能提供高質(zhì)量的數(shù)據(jù)和高度準確的變異檢出。
 

表1：外顯子組測序性能相當(dāng)

群體細胞mRNA測序
NextSeq 550和NextSeq 2000系統(tǒng)在測序數(shù)據(jù)輸出量和數(shù)據(jù)質(zhì)量方面都超過了公布的技術(shù)規(guī)范（表2）。通過群體細胞mRNA-Seq對特定RNA靶點進行定量，結(jié)果表明在四次重復(fù)實驗中兩個平臺之間具有良好的一致性（R²>0.99）（圖1）。這些數(shù)據(jù)證實了在定量 mRNA 表達水平時，NextSeq 2000系統(tǒng)生成的數(shù)據(jù)質(zhì)量與NextSeq 550系統(tǒng)相當(dāng)。
 

表2：群體細胞mRNA-Seq性能相當(dāng)
 

圖1：高度一致的mRNA-Seq結(jié)果——使用NextSeq 550系統(tǒng)通過細胞群mRNA-Seq 對特定 RNA 靶點進行定量，并繪制在 y 軸上。NextSeq 2000 系統(tǒng)的結(jié)果繪制在 x 軸上。沿著 y = x 趨勢線觀察數(shù)據(jù)的一致性（四次重復(fù)試驗的R²>0.99）。

單細胞全轉(zhuǎn)錄組測序
NextSeq 550和 NextSeq 2000系統(tǒng)在測序數(shù)據(jù)輸出量和數(shù)據(jù)質(zhì)量方面都超過了公布的技術(shù)規(guī)范（表3）。在 scRNA-Seq 中使用獨特分子標(biāo)簽（UMI）對單個細胞進行定量，結(jié)果表明在四次重復(fù)實驗中兩個平臺之間具有良好的一致性（R²>0.99）（圖2）。這些數(shù)據(jù)進一步證明在開展 scRNA-Seq 研究時，NextSeq 2000系統(tǒng)生成的數(shù)據(jù)質(zhì)量與NextSeq 550 系統(tǒng)相當(dāng)。
 

表3：scRNA-Seq性能相當(dāng)
 

圖2：scRNA-Seq結(jié)果高度一致——使用 NextSeq 550 系統(tǒng)通過 scRNA-Seq 對單個細胞（UMI）進行定量，并繪制在 y 軸上。NextSeq 2000 系統(tǒng)的結(jié)果繪制在 x 軸上。沿著 y = x 趨勢線觀察數(shù)據(jù)的一致性（四次重復(fù)試驗的 R²>0.99）。

總結(jié)/Summary
NextSeq 1000和NextSeq 2000測序系統(tǒng)具有突破性的系統(tǒng)設(shè)計、創(chuàng)新的化學(xué)測序技術(shù)并且機載生信分析軟件，徹底改變了臺式測序系統(tǒng)的性能。這些平臺降低了測序成本并提高了運行能力，同時保持了用戶對Illumina期望的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。將常在NextSeq 550 系統(tǒng)上運行的關(guān)鍵應(yīng)用數(shù)據(jù)，包括外顯子組、群體細胞mRNA和單細胞 RNA 測序，直接與NextSeq 2000系統(tǒng)生成的數(shù)據(jù)進行比較。結(jié)果顯示，NextSeq 550和NextSeq 2000系統(tǒng)的性能高度一致，反映了 Illumina對始終提供一致、高質(zhì)量的測序性能的承諾。

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如需下載本說明中提及的數(shù)據(jù)集，請訪問：basespace.illumina.com/datacentral

僅供研究使用。不得用于診斷。

參考文獻

1. Data calculations on file. Illumina, Inc. 2017.

2. Based on a comparison of the top three industry-leading NGS platforms. Data calculations on file. Illumina, Inc. 2016.

3. Ross MG, Russ C, Costello M, et al. Characterizing and measuring bias in sequence data. Genome Biol. 2013;14:R51.

4. Eberle MA, Fritzilas E, Krusche P, et al. A reference data set of 5.4 million phased human variants validated by genetic inheritance from sequencing athree-generation 17-member pedigree. Genome Res. 2017;27:157–164.