2021年4月15日，《cell》第8期184卷上刊出文章“Simultaneous binding of Guidance Cues NET1 and RGM blocks extracellular NEO1 signaling[1]”

摘要： 在細胞遷移和分化過程中，細胞的表面受體可以同時結合不同的配體，然而，對于如何整合這些細胞外信號的了解卻比較少。當Netrin-1（NET1）結合配體時，Neogenin（NEO1）會充當具有吸引力的引導受體，但它也會通過排斥性導向分子（RGM）介導排斥。文章揭示，通過三元聚合物（NEO1-NET1-RGM）復合物的形成進而整合了細胞外的信號并觸發(fā)了下游信號的相互沉默。作者通過NEO1-NET1-RGM結構揭示了存在于細胞膜中的“三聚體”超級組裝，并且這個超級組裝形成的三聚體會通過阻斷RGM-NEO1復合物形成的信號以及NET1誘導下的NEO1胞外聚集，進而抑制RGMA介導的生長錐塌陷以及RGMa或NET1-NEO1介導的神經元遷移。這些結果驗證了當兩個具有相反功能的配體與單個受體同時結合時，不會導致競爭性結合，而是會形成降低其功能的超級復合物。

圖1. “3-3”聚合體的作用示意圖

結果：為了剖析通過RGM和NET1相互作用控制NEO1信號傳導的分子機制，作者使用了表面等離子體共振（SPR）以及細胞表面結合實驗確定了NET1-NEO1相互作用的最小結合區(qū)域，測試表明，最小復合物由NEO1的三個靠近膜的FN結構域（NEO1FN456）以及一個缺少了C端的NTR結構域的NET1（NET1NTR）組成，這也與之前的研究結果一致。

圖2 NEO1、NET1、RGMB的示意圖

由于細胞可以在體內以依賴NEO1 的方式同時遇到 RGM 和 NET1，作者探究細胞表面是否存在穩(wěn)定的三元NEO1-NET1-RGM復合物，或者NET1和RGM是否會競爭結合NEO1。為了探究這兩種區(qū)別，作者采用Proximity Ligation Assay（PLA）實驗，將經過細胞表達并純化的全長的NEO1與NETNTR以及全長的胞外RGMB進行相互培養(yǎng)，觀察到遇到PLA現(xiàn)象，并且只有當NET1與RGMB非常接近且距離＜40nm時才會產生。當RGMB突變?yōu)椴豢涉溄覰ET1時，PLA現(xiàn)象明顯減少。結果表明，NEO1是連接NET1和RGMB所必需的，并且會在細胞表面形成三元復合物。

圖3. NEO1-NET1-RGMB三聚體

為了揭示NEO1、NET1以及RGMB如何組裝成三元復合物，作者收集到復合物分辨率為3.25A晶體結構，并通過超速離心分析（AUC）和小角度X射線散射（SAXS）分析了“3-3”三聚體的溶液穩(wěn)定性，最終確定了超級復合體3：3：3NEO1-NET1-RGMB的基本組成。

“3-3”超級復合體的主體本質上是由NEO1和NET1之間的相互作用形成的。NET1是細長的且剛性的分子，使得與兩個相鄰NEO1分子接觸，以彌合超復合物。冷凍電鏡結果顯示，有四個N連接上蔗糖，另外有四個位置通過非共價連接了八硫酸酯鹽（SOS）分子，蔗糖八硫酸酯協(xié)助確認三元聚合物超級復合體比例。NET1和RGMB分子形成非常小的相互作用，同時也未觀察到NET1與溶液中RGMA以及RGMB的相互作用。這也表明了NET1-NEO1相互作用是形成“3-3“超級復合體的驅動力。

圖4. 三元NEO1-NET1-RGM復雜聚合物的功能性分析
（C、D、E、F、G詳細標明蔗糖八硫酸酯鹽在復雜三聚體表面的結合位置）

之前的研究結果表明，RGMB對DCC的結合親和力比NEO1低約1000倍。在該研究中該研究團隊顯示在CNs中敲除DCC對RGMA誘導的生長錐塌陷沒有影響，也沒有影響NET1調節(jié)這種效應的能力。DCC缺失不影響NET1介導的神經細胞遷移，也不影響RGMA或RGMB抑制這種作用的能力。這支持RGM抑制可能歸因于三元NEO1-NET1-RGM復合物的觀點。NEO1與DCC一起的不同進化可以通過信號轉導中對三元NEO1-NET1-RGM復合物的需求來解釋。

該研究團隊的研究表明，NET1可以沉默RGMA介導的中樞神經系統(tǒng)生長錐塌陷，需要NEO1，RGMA和RGMB抑制NET1對神經細胞遷移的積極作用。NET1介導的神經細胞遷移在體外以劑量依賴性方式被RGMA抑制。這些數(shù)據(jù)表明NET1和RGMA和RGMB在功能上相互作用，并且它們的同時呈現(xiàn)導致其下游效應的相互沉默，這與三元復合物起到沉默受體信號傳導的作用一致。

該實驗也拓寬了蔗糖八硫酸酯鹽的應用范圍，在制備冷凍電鏡樣品或蛋白質修飾中均存在一定的應用價值。由于其獨特的負電性，可以在蛋白表面尋找可能的結合位點，并且通過分子量變化，進而確定多聚體蛋白質的組成，確定蛋白質復合物的各組分比例，為探索蛋白間的相互作用提供可能。

[1] Robinson RA, Griffiths SC, van de Haar LL, et al. Simultaneous binding of Guidance Cues NET1 and RGM blocks extracellular NEO1 signaling. Cell. 2021;184(8):2103-2120.e31. doi:10.1016/j.cell.2021.02.045