腫瘤內(nèi)可含有B細(xì)胞和漿細(xì)胞的浸潤，但B細(xì)胞系的腫瘤浸潤性細(xì)胞作用和抗原特異性尚不清楚。本文利用10x單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)探究了HPV陽性頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者腫瘤微環(huán)境中體液免疫反應(yīng)的抗原特異性。

文章詳情

文章題目：Defining HPV-specific B cell responses in patients with head and neck cancer.
中文題目：HPV特異性B細(xì)胞在頭頸癌患者的應(yīng)答
發(fā)表時(shí)間：2021.09
期刊名稱：Nature
影響因子：49.962
實(shí)驗(yàn)平臺(tái)：10x Genomics Chromium scRNA-seq
DOI：10.1038/s41586-020-2931-3

研究內(nèi)容

TME中存在HPV特異性的ASCs
研究者首先從表達(dá)p16的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）患者組織的FFPE切片中提取DNA并檢測到人乳頭瘤病毒（HPV）的DNA，p16是HPV狀態(tài)的替代標(biāo)志物。接下來，研究者在原發(fā)性腫瘤的腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞（TILs）、轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)（metLNs）和p16⁺ HNSCC患者中外周血單核細(xì)胞（PBMCs）里計(jì)算抗體分泌細(xì)胞（ASCs）的數(shù)量。與PBMCs相比，TILs和metLNs中ASCs的富集程度更高。隨后研究者嘗試探究腫瘤微環(huán)境（TME）中的ASCs是否產(chǎn)生針對(duì)HPV抗原的特異性抗體。由于TME中IgG⁺ ASCs經(jīng)常出現(xiàn)，故利用經(jīng)典的HPV癌基因E6和E7，和調(diào)節(jié)蛋白E2來研究抗原特異性IgG⁺ ASCs特征。與宮頸癌不同，E2在大多數(shù)HPV相關(guān)的HNSCC中都有表達(dá)。在所測試的抗原中，E2的特異性反應(yīng)占主導(dǎo)地位，18例患者配對(duì)的metLN和TIL樣品里HPV特異性IgG⁺ ASCs的頻率具有相關(guān)性。然而在外周血中檢測不到HPV特異性的ASCs，說明這是一種區(qū)域性的ASC反應(yīng)。而在p16^- HNSCC腫瘤中，淋巴細(xì)胞浸潤程度明顯降低，且缺乏HPV特異性的IgG⁺ ASCs和IgG⁺記憶B細(xì)胞（MBCs）。綜上所述，研究者發(fā)現(xiàn)TME中產(chǎn)生的HPV特異性IgG抗體處于活躍狀態(tài)，而E2蛋白是體液免疫反應(yīng)的主要靶點(diǎn)。

Fig.1 HPV陽性HNSCC患者TME中存在HPV特異性抗體分泌細(xì)胞

人HPV特異性抗體的生成
研究者在之前的研究中鑒定到一類抗原特異性B細(xì)胞并命名為“激活的B細(xì)胞”（ABCs）,是與ASCs不同的增殖細(xì)胞，屬于MBC譜系并在接種疫苗或感染后出現(xiàn)在外周血液中。為了確認(rèn)TME中是否存在HPV特異性ABCs并能產(chǎn)生HPV特異性人單克隆抗體，研究者利用流式分選技術(shù)和熒光標(biāo)記的E2蛋白從HPV+ metLNs中純化出HPV特異性ABCs，并制備單克隆抗體。此外，研究者還從單細(xì)胞分選的ASCs中獲得另一種E2特異性單克隆抗體。E2特異性單克隆抗體在重鏈和輕鏈可變區(qū)表現(xiàn)出高度的體細(xì)胞超突變（SHM）。E2特異性單克隆抗體的重鏈可變區(qū)平均有28個(gè)SHM，明顯高于急性病毒感染、潛伏性病毒感染等情況下產(chǎn)生的抗體，與HIV相當(dāng)。研究者還從另一患者的ASCs中克隆到3種E6特異性抗體，也顯示出高度的SHM。這些結(jié)果表明TME中存在針對(duì)腫瘤相關(guān)病毒抗原的ABCs和ASCs，而且ABC的存在和HPV特異性抗體中高水平的SHM暗示對(duì)這些病毒抗原長期不間斷的體液免疫反應(yīng)。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析TME中的B細(xì)胞
研究者使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)從3例HPV+HNSCC患者metLNs和TILs中獲得的純化細(xì)胞測序分析TME中B細(xì)胞系活化細(xì)胞的組成。此外，研究者還對(duì)一例接種季節(jié)性流感病毒疫苗的健康人外周血中分離出的活化細(xì)胞（接種7天后）進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序。上述所有單細(xì)胞測序共獲得8271個(gè)細(xì)胞的結(jié)果，并鑒定到4種細(xì)胞類群，根據(jù)基因表達(dá)譜和基因集富集分析結(jié)果將這4群命名為ABC、ASC、生發(fā)中心B細(xì)胞（GCB）和暫時(shí)性細(xì)胞（表現(xiàn)為ASC、GCB和增殖基因集富集的雜交表型）。雖然這四種細(xì)胞類群中均含有來自metLNs和TILs的活化細(xì)胞，但是在GCB中沒有接種疫苗的健康人細(xì)胞，在暫時(shí)性細(xì)胞里也幾乎沒有。這些結(jié)果表明，TME中包含幾種抗原刺激過的B細(xì)胞類群：ABC、GCB和ASC。

為了研究三種主要B細(xì)胞類群的轉(zhuǎn)錄組差異，從患者和接種疫苗的健康人中分離出這三類細(xì)胞進(jìn)行研究。首先利用主成分分析鑒定到兩個(gè)主成分（PC），總共解釋了大約６０％觀察到的轉(zhuǎn)錄差異。PC1解釋了41%的轉(zhuǎn)錄差異，能夠區(qū)分ASC、ABC和GCB，并將組織和血液中的ABC區(qū)分開。在不考慮樣品來源的情況下，ASC中常見的ASC相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)而B細(xì)胞系基因表達(dá)下調(diào)。腫瘤來源的ASC除了上述特征，漿細(xì)胞相關(guān)基因也上調(diào)表達(dá)，表明腫瘤相關(guān)的ASC細(xì)胞表型更像漿細(xì)胞。GCB高表達(dá)的基因表明其促進(jìn)對(duì)生發(fā)中心的限制作用。來源于外周血的流感特異性細(xì)胞與腫瘤來源的細(xì)胞不同，高表達(dá)參與細(xì)胞遷移的基因。TME中的B細(xì)胞和漿細(xì)胞可通過多種免疫調(diào)節(jié)蛋白抑制抗腫瘤免疫。值得注意的是，除了低水平表達(dá)到中等水平表達(dá)GZMB、IDO1和TGFBI的ASCs外，大多數(shù)前人描述的免疫調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平都是不可檢測或表達(dá)水平低，與初始B細(xì)胞的表達(dá)水平相當(dāng)。

Fig.2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序鑒定TME中細(xì)胞類型組成

Fig.3 TME中B細(xì)胞和漿細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和空間特征

主要結(jié)論
本研究在HPV陽性的頭頸癌患者樣品中檢測到HPV特異性的B細(xì)胞反應(yīng)，并在原位產(chǎn)生HPV特異性IgG抗體。ASC細(xì)胞存在于TME中，而流感特異性細(xì)胞招募最少，表明存在局部的抗原特異性ASC反應(yīng)。HPV特異性ASC反應(yīng)與血漿IgG滴度相關(guān)，該反應(yīng)針對(duì)HPV蛋白E2、E6和E7，其中對(duì)E2的反應(yīng)最明顯。研究者通過腫瘤內(nèi)的B細(xì)胞和漿細(xì)胞生成了幾種HPV特異性的人單克隆抗體，這些抗體表現(xiàn)出高水平的體細(xì)胞超突變，與慢性抗原暴露一致。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析檢測到TME中存在ABC、GCB和ASC。與腫瘤實(shí)質(zhì)相比，B細(xì)胞和ASC優(yōu)先定位于腫瘤間質(zhì)，與ABC一起，表明生發(fā)中心反應(yīng)正在進(jìn)行。總體而言，研究者發(fā)現(xiàn)TME中存在抗原特異性活化細(xì)胞、GCB和漿細(xì)胞，為人類癌癥體液免疫反應(yīng)研究提供信息并提示腫瘤浸潤性B細(xì)胞可以被用于開發(fā)治療藥物。

參考文獻(xiàn)
Wieland, Andreas et al. “Defining HPV-specific B cell responses in patients with head and neck cancer.” Nature vol. 597,7875 (2021): 274-278.