循環(huán)拉伸是一種可以在貼壁細(xì)胞中研究的過(guò)程，這些細(xì)胞接種在柔性表面上，然后周期性地進(jìn)行拉伸。這一過(guò)程創(chuàng)造了一個(gè)動(dòng)態(tài)環(huán)境，模擬不斷收縮的器官，如肺、心臟和肌肉組織。多項(xiàng)研究表明，拉伸會(huì)激活信號(hào)通路。例如，拉伸的肌肉細(xì)胞會(huì)激活 Nox4 信號(hào)通路，并增強(qiáng)核蛋白導(dǎo)入。
 

磷酸化是細(xì)胞的一個(gè)重要方面。例如，表皮生長(zhǎng)因子受體 (EGFR)（質(zhì)膜上的一種酪氨酸激酶受體）的體細(xì)胞突變會(huì)導(dǎo)致自身磷酸化和組成型激活，從而導(dǎo)致癌癥中細(xì)胞分裂。刺激誘導(dǎo)的信號(hào)改變背后的蛋白質(zhì)磷酸化的特性可能為細(xì)胞中生理事件的調(diào)節(jié)提供重要的見解。近年來(lái)，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析的最新進(jìn)展使研究人員能夠研究信號(hào)通路的異常調(diào)控。
 

肺癌是導(dǎo)致死亡的主要原因。大多數(shù)以前的研究都是基于傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)方法。然而，肺細(xì)胞在呼吸過(guò)程中會(huì)周期性地受到機(jī)械力的影響。因此，了解肺細(xì)胞中誘導(dǎo)的循環(huán)拉伸的潛在機(jī)制可能對(duì)肺癌治療很重要。

基于此，臺(tái)灣中央研究院與國(guó)立臺(tái)灣大學(xué)基因體與系統(tǒng)生物學(xué)的學(xué)位項(xiàng)目進(jìn)行了相關(guān)研究，首先應(yīng)用磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來(lái)分析人 A549 肺癌細(xì)胞和 IMR-90 肺成纖維細(xì)胞中拉伸誘導(dǎo)的磷酸蛋白質(zhì)組。此外，使用生物信息學(xué)工具和統(tǒng)計(jì)方法分析了不同的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)狀態(tài)，從而揭示了拉伸誘導(dǎo)的生物功能。
 

在這項(xiàng)研究中，對(duì)兩個(gè)細(xì)胞系應(yīng)用了短期（15、30 和 60 分鐘）和長(zhǎng)期（24 小時(shí)）的拉伸。循環(huán)拉伸實(shí)驗(yàn)采用 10% 的 CSA 變化和單軸拉伸方向。對(duì)收集的蛋白質(zhì)進(jìn)行消化和加工，然后使用 TiO2 進(jìn)行磷酸肽的富集，通過(guò)質(zhì)譜法分析磷酸肽。使用 MaxQuant 軟件對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)進(jìn)行量化和鑒定。最后對(duì)拉伸誘導(dǎo)的基因組和磷酸化蛋白質(zhì)組差異表達(dá)基因/蛋白質(zhì)進(jìn)行了功能富集。

圖1  循環(huán)拉伸誘導(dǎo)的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析的實(shí)驗(yàn)步驟和工作流程
 

一些磷酸位點(diǎn)在兩種細(xì)胞系中都表現(xiàn)出對(duì)拉伸的敏感性，例如 SEPT9 Ser30 和 Zyxin Ser281。SEPT9 Ser30 的磷酸化促進(jìn)了 HeLa 細(xì)胞中的細(xì)胞粘附。先前的研究表明，拉伸會(huì)破壞緊密的連接和粘附。SEPT9 Ser30 在 IMR-90 和 A549 細(xì)胞中均上調(diào)。因此，該實(shí)驗(yàn)認(rèn)為這種磷酸化有助于細(xì)胞對(duì)拉伸的反應(yīng)。
 

同樣，磷酸化的 Zyxin Ser281 與 CDK8 相互作用，從而激活 YAP 介導(dǎo)的有絲分裂。該磷酸位點(diǎn)在兩種細(xì)胞系中均顯示下調(diào)。其他磷位點(diǎn)顯示出不同程度的改性。據(jù)報(bào)道，AKT1S1S Ser203 磷酸位點(diǎn)可激活 mTORC 信號(hào)通路，從而增強(qiáng)致癌性生長(zhǎng)。該磷酸位點(diǎn)在 A549 癌細(xì)胞中上調(diào)，但在 IMR-90 成纖維細(xì)胞中下調(diào)。

在功能網(wǎng)絡(luò)分析中，發(fā)現(xiàn) A549 和 IMR-90 細(xì)胞均富集細(xì)胞骨架組織和細(xì)胞成分組織。為了深入了解循環(huán)拉伸誘導(dǎo)的生物學(xué)功能，應(yīng)用了聚類分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞-細(xì)胞粘附功能顯示兩種細(xì)胞系中六個(gè)簇的顯著富集。然后進(jìn)一步研究了循環(huán)拉伸后是否會(huì)發(fā)生細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，隨后觀察到循環(huán)拉伸后的細(xì)胞重排。在血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象。

細(xì)胞重排是由機(jī)械拉伸誘導(dǎo)的，這種拉伸經(jīng)常發(fā)生在各種細(xì)胞類型中，有趣的是，在研究中使用的 A549 和 IMR-90 細(xì)胞系中也觀察到了這種現(xiàn)象。細(xì)胞重新定向是對(duì)循環(huán)拉伸的常見反應(yīng)，與此一致，在涉及絲狀聚合和合成的蛋白質(zhì)（包括肌動(dòng)蛋白絲、肌球蛋白和微管）上發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)顯著改變的磷酸位點(diǎn)。研究人員認(rèn)為這些磷蛋白可能與循環(huán)拉伸誘導(dǎo)的細(xì)胞重排有關(guān)。

此外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)線粒體和高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)及其生物合成是功能富集的結(jié)果。結(jié)合拉伸誘導(dǎo)的基因表達(dá)和功能注釋，發(fā)現(xiàn)與線粒體組織相關(guān)的功能是通過(guò)循環(huán)拉伸調(diào)控的。該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，30 分鐘和 24 小時(shí)的拉伸可以延長(zhǎng)線粒體長(zhǎng)度，這可能與 IMR-90 和 A549 細(xì)胞的線粒體動(dòng)力學(xué)有關(guān)。

圖2  循環(huán)拉伸作用下被顯著調(diào)控的必需蛋白中幾個(gè)磷酸位點(diǎn)可能參與的特定生物學(xué)功能。
 

A 微管相關(guān)蛋白1B（MAP1B）和谷氨酸受體相互作用蛋白1（GRIP1）之間的相互作用可以減慢線粒體運(yùn)動(dòng)。
B 肌球蛋白參與線粒體斷裂。
C 表皮生長(zhǎng)因子受體 (EGFR) 信號(hào)的激活增強(qiáng)了肌球蛋白 IIA 的活性。
D 在兩種細(xì)胞系中，通過(guò)循環(huán)拉伸激活了幾種粘著斑相關(guān)蛋白。粘著斑活性的變化導(dǎo)致細(xì)胞重排。

在該研究中，磷酸化蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)揭示了響應(yīng)循環(huán)拉伸的細(xì)胞類型特異性和常見磷酸化位點(diǎn)。此外，證明了細(xì)胞重排是細(xì)胞抵抗持續(xù)拉伸的一種策略，并表明細(xì)胞拉伸可增加線粒體長(zhǎng)度�？傊�，周期性循環(huán)拉伸引起的磷酸化水平變化可能為動(dòng)態(tài)細(xì)胞拉伸提供新的視角。

參考文獻(xiàn)：Wang WH, Hsu CL, Huang HC, Juan HF. Quantitative Phosphoproteomics Reveals Cell Alignment and Mitochondrial Length Change under Cyclic Stretching in Lung Cells. Int J Mol Sci. 2020 Jun 7;21(11):4074. doi: 10.3390/ijms21114074. PMID: 32517296; PMCID: PMC7312583.
圖片來(lái)源：所有圖片均來(lái)源于參考文獻(xiàn)

小編旨在分享、學(xué)習(xí)、交流生物科學(xué)等領(lǐng)域的研究進(jìn)展。如有侵權(quán)或引文不當(dāng)請(qǐng)聯(lián)系小編修正。關(guān)注公眾號(hào)Naturethink了解更多科研資訊！