Vero細(xì)胞是基因工程常用細(xì)胞的一種，使用生物反應(yīng)器進(jìn)行Vero細(xì)胞規(guī)�；瘮U(kuò)增培養(yǎng)是基因制藥的關(guān)鍵工藝。

一、Vero一次傳代細(xì)胞培養(yǎng)
1. Vero細(xì)胞洗脫和收集：
購買回來的Vero細(xì)胞的一般采用懸浮培養(yǎng)的方式在培養(yǎng)瓶中進(jìn)行接種培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞增殖到傳代數(shù)量時可用DPBS緩沖液進(jìn)行洗滌，經(jīng)過兩次充分稀釋后再用從培養(yǎng)瓶中收集細(xì)胞。
2. 轉(zhuǎn)瓶擴(kuò)增：
用于Vero細(xì)胞增殖的培養(yǎng)基的主要成分有：含胎牛血清、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、抗真菌抗生素等成分的DMEM。根據(jù)產(chǎn)物的不同所使用的微載體也不相同，由于Hillex®微載體具有陽離子胺改性微孔表面可以在不影響細(xì)胞收獲效率的情況下提高細(xì)胞吸引和附著性的特點(diǎn)，所以在Vero細(xì)胞改造中被廣泛使用。傳統(tǒng)Hillex® II微載體制備，需在121℃的去離子水中進(jìn)行高壓滅菌30分鐘左右。細(xì)胞接種在微載體中的參考密度為18-19個細(xì)胞/載體。培養(yǎng)條件為恒溫37°C;培養(yǎng)箱內(nèi)二氧化碳濃度以5%左右為宜。

二、Vero二次傳代細(xì)胞培養(yǎng)
當(dāng)細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶中的培養(yǎng)密度達(dá)到指定擴(kuò)培值后，按實(shí)驗(yàn)要求向轉(zhuǎn)瓶中添加一定量的DPBS進(jìn)行微載體清洗，這個步驟需要注意的是不要講DPBS溶液直接倒在微載體上以防細(xì)胞脫附。清洗2-3次后，倒出清洗液，加入胰蛋白酶溶液消化10分鐘左右即可形成單細(xì)胞懸浮液。此時可以用來進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞存活率統(tǒng)計(jì)。當(dāng)細(xì)胞密度和存活率達(dá)到指定標(biāo)準(zhǔn)值，即可轉(zhuǎn)入5L的微載體培養(yǎng)生物反應(yīng)器中進(jìn)行進(jìn)行二次傳代培養(yǎng)。微載體生物反應(yīng)器經(jīng)高壓滅菌后，加入培養(yǎng)基。在添加細(xì)胞之前，培養(yǎng)基的pH值參數(shù)為7.2左右，調(diào)至7.2，DO值的設(shè)定以空氣飽和度的30%左右為宜。轉(zhuǎn)速設(shè)置在60 rpm左右；細(xì)胞添加期間，攪拌速率需增加至70 rpm，加入細(xì)胞后恢復(fù)為60 rpm。在微載體培養(yǎng)過程中通過氣體控制及通氧量來控制DO值。

從培養(yǎng)第2天起需要每天向生物反應(yīng)器內(nèi)批量灌注培養(yǎng)基及營養(yǎng)液，以補(bǔ)充養(yǎng)分消耗。

每天從取樣口處取樣采集，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法來分析細(xì)胞密度。正常培養(yǎng)下，5天左右即可達(dá)到指定擴(kuò)增值。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到收獲值時，即可轉(zhuǎn)入下一個階段的擴(kuò)增生產(chǎn)。

三、Vero三次傳代細(xì)胞培養(yǎng)
通過取樣測定檢測，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到指定的收獲密度時，即可關(guān)閉攪拌器停止攪拌，使微載體沉降，此時吸取上層的培養(yǎng)液，緩慢加入DPBS緩沖液進(jìn)行細(xì)胞清洗，收獲細(xì)胞。

三次細(xì)胞傳代可選用15L的大容量生物反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增。擴(kuò)增培養(yǎng)過程與二次傳代工藝流程相同，只是每個階段的DO值、pH值、攪拌槳轉(zhuǎn)速等參數(shù)設(shè)置會有不同，需要參考生物反應(yīng)器的標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)相關(guān)規(guī)定進(jìn)行操作。當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)到指定值時進(jìn)入下一階段生產(chǎn)。

從以上步驟我們可以看出生物反應(yīng)器在進(jìn)行抗體蛋白的生產(chǎn)、基因制藥和濃縮方面都具有著不可替代的作用。通過生物反應(yīng)器進(jìn)行載體培養(yǎng)技術(shù)可實(shí)現(xiàn)疫苗產(chǎn)品的GMP規(guī)�；�生產(chǎn)需求。