人肝細(xì)胞癌是一種高死亡率的原發(fā)性肝癌，也是全球范圍最常見的惡性腫瘤之一。遺傳、表觀遺傳改變和病毒感染是肝癌的主要誘發(fā)因素。由于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高，肝細(xì)胞癌的死亡率較高。為了研究人肝細(xì)胞癌的免疫抑制機(jī)制，本文作者使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，分析細(xì)胞間相互作用，剖析腫瘤的細(xì)胞異質(zhì)性。

文章詳情 

文章題目：Single-cell RNA sequencing shows the immunosuppressive landscape and tumor heterogeneity of HBV-associated hepatocellular carcinoma.

中文題目：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組揭示HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌的免疫抑制譜和腫瘤異質(zhì)性

發(fā)表時(shí)間：2021.06

期刊名稱：Nature Communications

影響因子：14.911

實(shí)驗(yàn)平臺(tái)：10x Genomics Chromium scRNA-seq

DOI：10.1038/s41467-021-24010-1

研究背景

人肝細(xì)胞癌（HCC）由復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境 (TME) 組成，由細(xì)胞（腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞）、化學(xué)成分（趨化因子）和物理成分（細(xì)胞外基質(zhì)）組成。這些相互作用以支持 HCC 的發(fā)展并影響治療反應(yīng)。對(duì)HCC的傳統(tǒng)研究主要針對(duì)大塊腫瘤組織，缺少TME中單個(gè)細(xì)胞的精確信息，而單細(xì)胞測(cè)序則成為研究癌癥的重要平臺(tái)。關(guān)于HCC，使用單細(xì)胞測(cè)序研究的案例還很少，而且這些案例在揭示整體多方面狀態(tài)和交互作用方面存在限制性。研究者近期對(duì)源自患者的HCC腫瘤異種抑制模型進(jìn)行研究，確定了與干細(xì)胞相關(guān)的腫瘤細(xì)胞亞群。由于該模型的免疫受損背景和非人類物種的限制，本文對(duì)一組乙型肝炎病毒（HBV）相關(guān)的HCC臨床樣品進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究，從而更好的概括人HCC中實(shí)際發(fā)生的生物學(xué)過程。

研究?jī)?nèi)容
// HBV相關(guān)的HCC患者的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜  

研究者對(duì)8個(gè)人HCC患者的腫瘤組織解離并分選去除死細(xì)胞，隨后進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得了34個(gè)細(xì)胞亞群。結(jié)果表明，惡性細(xì)胞與非惡性細(xì)胞聚集成不同的細(xì)胞亞群，來自不同病例的惡性細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞）分布在不同的細(xì)胞簇中，而來自多個(gè)病例的非惡性細(xì)胞聚集在一起，說明腫瘤間異質(zhì)性水平相對(duì)較高。計(jì)算細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞比例可能有負(fù)相關(guān)關(guān)系，并利用bulk-RNA測(cè)序結(jié)果和TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行驗(yàn)證，說明腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）的豐度可能用于預(yù)測(cè)腫瘤浸潤(rùn)性T細(xì)胞是否稀缺。

Fig.1 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組揭示TAM和CD8⁺T細(xì)胞之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系

// TAMs免疫抑制標(biāo)志物表達(dá)及預(yù)后意義   

TAMs中，LAIR1、HAVCR2（也稱為 TIM3）、LGALS9 和 VSIR 富集表達(dá)，特異性強(qiáng)。研究者發(fā)現(xiàn)在不同細(xì)胞群中CD163（M2 巨噬細(xì)胞 marker）和LAIR1的富集模式最相似，結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫中的RNA-seq數(shù)據(jù)集檢測(cè)到這兩個(gè)基因的表達(dá)顯著相關(guān)，因此研究者猜測(cè)TAM 的免疫抑制功能可能是通過 LAIR1 發(fā)揮的，LAIR1 在 M2 巨噬細(xì)胞中具有免疫抑制作用。生存分析表明這兩個(gè)基因的高表達(dá)均與HCC患者較差的生存期顯著相關(guān)，免疫熒光染色也能頻繁觀察到LAIR1和M2巨噬細(xì)胞重疊，LAIR1和CD163經(jīng)常共表達(dá)。這些結(jié)果都支持M2 巨噬細(xì)胞中 LAIR1 富集表達(dá)的假設(shè)。

// 不同的腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞亞群軌跡分析   

為了確定TME中細(xì)胞狀態(tài)的演變關(guān)系，研究者進(jìn)行了多種腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的擬時(shí)間序列分析，包括CD8⁺T、CD4⁺T、Treg、NK和TAM。CD8⁺T 和NK細(xì)胞逐漸過渡到具有衰竭狀態(tài)的亞群狀態(tài)，Treg細(xì)胞向更具免疫抑制狀態(tài)的方向改變，TAM則向更具有免疫異質(zhì)性的M2巨噬細(xì)胞狀態(tài)改變，CD4⁺T主要是Th1和Th2細(xì)胞類型。這些結(jié)果表明免疫細(xì)胞向更具耗竭性或免疫抑制性狀態(tài)轉(zhuǎn)變，并描繪了HCC腫瘤中的整體免疫抑制性細(xì)胞圖譜。

Fig.2 主要免疫細(xì)胞類型的擬時(shí)間序列分析

// 免疫檢查點(diǎn)的免疫抑制譜   

研究者接下來確認(rèn)了免疫檢查點(diǎn)成分在腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞和互補(bǔ)抗原呈遞細(xì)胞（APC）中的表達(dá)情況。利用細(xì)胞間互作分析（如：T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞），評(píng)估不同共刺激和共抑制檢查點(diǎn)在塑造HCC免疫抑制譜中的相對(duì)貢獻(xiàn)。通過 TIGIT-NECTIN2 確定了一個(gè)突出的共抑制信號(hào)，而NECTIN2（PVRL2）是 PVR 基因家族中表達(dá)最高的基因。在研究者內(nèi)部隊(duì)列和TCGA隊(duì)列中，與相應(yīng)的非腫瘤肝臟相比，HCC 中的 NECTIN2 顯著上調(diào)。此外，對(duì)一組HCC和一組與HCC或HBV無關(guān)的肝硬化患者進(jìn)行IHC檢測(cè)TIGIT 和 NECTIN2 表達(dá)。結(jié)果表明，這兩個(gè)蛋白在HCC中表達(dá)顯著相關(guān)，而與HCC或HBV無關(guān)肝硬化組中則沒有相關(guān)性，這說明TIGIT-NECTIN2 軸可能是一種腫瘤逃避策略，而不是病毒逃避策略。與非腫瘤相比，腫瘤中NECTIN2表達(dá)顯著上調(diào)， 說明NECTIN2過表達(dá)可能對(duì)構(gòu)建 HCC 發(fā)展中的免疫抑制譜很重要。研究者還在Treg 細(xì)胞中檢測(cè)到多種免疫抑制免疫檢查點(diǎn)基因的大量表達(dá)。此外，雖然PD-1 (PDCD1) 和 PD-L1/L2 (CD274/PDCD1LG2) 之間的相互作用很小，但在 Treg 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中CTLA4-CD86 和 HAVCR2-LGALS9 軸的共抑制信號(hào)很大。

Fig.3 HCC免疫檢查點(diǎn)分析揭示TIGIT-NECTIN2 相互作用重要性

與 PVR/NECTIN2 連接后，TIGIT 充當(dāng) T 和 NK 細(xì)胞的抑制性受體。為了研究在 HCC 細(xì)胞上表達(dá)的 NECTIN2 是否會(huì)導(dǎo)致 T 細(xì)胞耗竭，研究者在小鼠HCC細(xì)胞系Hepa1-6中用Crisper-Cas9敲除系統(tǒng)構(gòu)建了Nectin2穩(wěn)定敲除 (KO) 細(xì)胞。將Hepa1-6和小鼠脾臟T細(xì)胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，與獨(dú)自培養(yǎng)的T細(xì)胞相比，共培養(yǎng)系統(tǒng)中小鼠 HCC 細(xì)胞的存在顯著抑制了 CD4⁺或 CD8⁺T細(xì)胞的增殖，而Anti-Nectin2抗體在共培養(yǎng)系統(tǒng)中顯著恢復(fù) CD4⁺和 CD8⁺T細(xì)胞增殖能力。Nectin2敲除實(shí)驗(yàn)也證明該基因抑制了T細(xì)胞增殖。接下來，研究者在Tp53敲除和c-Myc過表達(dá)HCC小鼠構(gòu)建了Nectin2敲除模型，發(fā)現(xiàn)敲除鼠的HCC腫瘤變小，多種T細(xì)胞免疫浸潤(rùn)增強(qiáng)，IHC結(jié)果檢測(cè)到敲除模型中T細(xì)胞增加也進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果，且這些T細(xì)胞中的耗竭標(biāo)志物表達(dá)量沒有顯著改變。這些結(jié)果證明NECTIN2可限制 HCC 中 T 細(xì)胞浸潤(rùn)和活性的功能。

// HCC 腫瘤細(xì)胞的亞克隆異質(zhì)性和譜系層次   

研究者根據(jù)整體轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征對(duì)HCC腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分層，并發(fā)現(xiàn)HCC腫瘤細(xì)胞主要按照不同病例分層聚類，說明個(gè)體間異質(zhì)性比個(gè)體內(nèi)更強(qiáng)。接下來，根據(jù)一組LCSC marker基因表達(dá)模式進(jìn)行無監(jiān)督聚類，將細(xì)胞分為不同的LCSC marker組。盡管病例個(gè)體與LCSC marker組狀態(tài)存在一定的相關(guān)性，但同時(shí)表達(dá)EPCAM、ALDH1A1 和 CD24 的 LCSC marker組2的細(xì)胞聚集在一起并包含來自多個(gè)病例的 HCC 腫瘤細(xì)胞。它們可能代表一個(gè)分子上不同的腫瘤細(xì)胞亞群。此外，研究者為每個(gè)病例的HCC腫瘤細(xì)胞生成了全基因組CNV圖譜，并根據(jù)CNV變異程度構(gòu)建HCC腫瘤細(xì)胞的譜系層次，共獲得9個(gè)CNV組，且RTK家族基因表達(dá)特征具有患者間的異質(zhì)性�？傮w而言，這些發(fā)現(xiàn)表明個(gè)體病例的HCC腫瘤細(xì)胞基于全局轉(zhuǎn)錄組特征、LCSC marker、推斷的CNV狀態(tài)和RTK基因表達(dá)四個(gè)方面的相似性聚類在一起，從而證實(shí)腫瘤間異質(zhì)性程度比腫瘤內(nèi)更強(qiáng)。然而，每個(gè)HCC腫瘤中有主要和次要細(xì)胞亞克隆，說明腫瘤內(nèi)異質(zhì)性水平不可忽視，這可能會(huì)給傳統(tǒng)通過精確定位主要亞克隆的分子靶向治療帶來困難。

Fig.4 LCSC marker和推斷的CNV狀態(tài)方面的腫瘤異質(zhì)性

主要結(jié)論
研究者利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)探究了一組HBV相關(guān)的HCC患者的免疫譜和腫瘤異質(zhì)性，并發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞抑制腫瘤T細(xì)胞浸潤(rùn)，TIGIT-NECTIN2 相互作用調(diào)節(jié)免疫抑制環(huán)境。免疫細(xì)胞向更具免疫抑制性和耗竭性的細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變體現(xiàn)了促進(jìn)癌癥發(fā)展的整體免疫細(xì)胞譜。此外，全局分子特征的異質(zhì)性揭示了共存的腫瘤內(nèi)和腫瘤間異質(zhì)性，且腫瘤間異質(zhì)性更明顯。這種免疫抑制譜和細(xì)胞間相互作用的分析為設(shè)計(jì)有效的肝細(xì)胞癌免疫療法提供了機(jī)制信息。

參考文獻(xiàn)：
Ho, Daniel Wai-Hung et al. “Single-cell RNA sequencing shows the immunosuppressive landscape and tumor heterogeneity of HBV-associated hepatocellular carcinoma.” Nature communications vol. 12,1 3684. 17 Jun, 2021.