化合物在高通量篩選中的作用
在 1985 年之前，先導(dǎo)物的篩選主要是通過人工進(jìn)行的，每周處理的樣本數(shù)量不過幾百個(gè)，組合化學(xué)的出現(xiàn)使得科學(xué)家們獲取化合物的方式發(fā)生了顯著變化，他們可以在短時(shí)間內(nèi)合成大量化合物。
更重要的是，隨著分子生物學(xué)和功能基因組的研究發(fā)展，使得新穎靶標(biāo)大量增加，這種情況下，緩慢的人工篩選已經(jīng)沒有辦法滿足新藥研發(fā)的要求，高通量篩選技術(shù)的出現(xiàn)大大縮短了先導(dǎo)物開發(fā)在藥物發(fā)現(xiàn)中的時(shí)間。如今，一個(gè)普通的藥學(xué)高通量篩選實(shí)驗(yàn)室每天篩選的靶標(biāo)已經(jīng)超過 10 萬個(gè)。
HTS 可根據(jù)待測(cè)樣品的種類大致分為細(xì)胞水平篩選和分子水平篩選兩類。細(xì)胞水平篩選是在細(xì)胞個(gè)體水平上完成的檢測(cè)，由于含有諸如信號(hào)傳導(dǎo)、物質(zhì)代謝等關(guān)于細(xì)胞生命活動(dòng)的信息，因此可以省去體外篩選中的許多步驟。
下面將圍繞細(xì)胞水平篩選介紹幾種常用的檢測(cè)方法：離子通道檢測(cè)、報(bào)告基因檢測(cè)和細(xì)胞增殖檢測(cè)
離子通道是目前藥物發(fā)現(xiàn)的重要靶點(diǎn)。例如在心血管疾病中，離子通道檢測(cè)可以應(yīng)用于原發(fā)性電障礙 (長(zhǎng) QT 綜合癥、短 QT 綜合癥、Brugada 綜合癥) 等方面的藥物篩選。
以 Novel KCNQ2 channel activators discovered using fluorescence-based and automated patch-clamp-based high-throughput screening techniques 一文為例，通過一種改進(jìn)的高通量篩選技術(shù)，篩選新型 KCNQ2 通道激活劑。
在這篇文獻(xiàn)中，作者團(tuán)隊(duì)以 ZTZ240 (KCNQ2 通道激活劑) 作為陽性對(duì)照，通過鉈通量測(cè)定法從 80000 種化合物篩選出了 565 個(gè)比 ZTZ240 更強(qiáng)活性的化合物。然后使用 384 孔自動(dòng)化膜片鉗，進(jìn)一步篩選出了 38 個(gè) KCNQ2 通道激活劑。最后，使用傳統(tǒng)的膜片鉗表征激活劑，得到 ZG1732 和 ZG2083 (EC50 分別為 1.04 μM 和 1.37 μM)。
流程：穩(wěn)定表達(dá) KCNQ2 通道的 CHO 細(xì)胞 → 與染料緩沖液共培養(yǎng) → 在細(xì)胞板中加入不同的化合物孵育 → 鉈通量分析初步篩選 → 384 孔全自動(dòng)膜片鉗系統(tǒng)進(jìn)行撞擊驗(yàn)證 → 自動(dòng)化膜片鉗二次篩選。
以 Pharmacological enhancement of KCC2 gene expression exerts therapeutic effects on human Rett syndrome neurons and Mecp2 mutant mice 一文為例，作者團(tuán)隊(duì)通過開發(fā)建立了一種應(yīng)用于神經(jīng)元的高通量篩選方法。該文獻(xiàn)中，結(jié)合使用了 CRISPR-Cas9 技術(shù)，將熒光素酶報(bào)告基因插入人 ES 細(xì)胞的內(nèi)源 KCC2 基因位點(diǎn)中，通過檢測(cè)熒光來篩選特異性增強(qiáng) KCC2 達(dá)的化合物，最終從 900 種化合物中篩選出 14 個(gè) KEECs。
流程：培養(yǎng)人類胚胎干細(xì)胞 (ES 細(xì)胞) 結(jié)合 CRISPR-Cas9 技術(shù) → 將熒光素酶報(bào)告基因插入人 ES 細(xì)胞的內(nèi)源 KCC2 基因位點(diǎn) → 高通量篩選出能增強(qiáng) KCC2 表達(dá)的小分子 → 6 次重復(fù)篩選從 900 個(gè)化合物庫中篩選出 14 個(gè)起作用的小分子 → 通過 Western blot 和 RT-PCR 進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證。
細(xì)胞增殖檢測(cè)根據(jù)檢測(cè)內(nèi)容可以分為四類：ATP 濃度檢測(cè)、DNA 合成檢測(cè)、代謝活性檢測(cè)和細(xì)胞增殖相關(guān)抗原檢測(cè)。與細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)合的高通量篩選常用于鑒定能殺死各種癌細(xì)胞或病原體的化合物，還可以應(yīng)用于細(xì)胞缺陷疾病的藥物篩選。
以 Head and Neck Cancer Stem Cell-Enriched Spheroid Model for Anticancer Compound Screening 為例，作者團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種程序簡(jiǎn)單，培養(yǎng)時(shí)間短的干細(xì)胞富集球形模型 (SCESM)，適用于抗癌癥干細(xì)胞化合物的新高通量篩選方法 (HTSs)。
流程：特定細(xì)胞培養(yǎng) 7 天 → 含不同實(shí)驗(yàn)化合物的處理培養(yǎng)基替代掉一半莖培養(yǎng)液，處理 5 天 → 用 0.5% triton X-100 (Sigma-Aldrich) 在 4℃ 過夜培養(yǎng) → 用 7-AAD 和 Ki67 共染細(xì)胞 → 共聚焦顯微鏡捕獲熒光信號(hào) → 用 qPCR，F(xiàn)low cytometry，Western blot 驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果。
高通量篩選的實(shí)驗(yàn)方法必須具備條件穩(wěn)定，樣本之間差異性小，容易檢測(cè)，且可以大批量同時(shí)檢測(cè)等特性。除了以上介紹的三種較為常用的方法之外，第二信使檢測(cè)、細(xì)胞活力檢測(cè)等方法也是常用的細(xì)胞水平的檢測(cè)手段。
化合物庫的使用在篩選前期也起著十分重要的作用。在化合物未知的情況下，數(shù)量足夠大的化合物庫可增加識(shí)別目標(biāo)的概率；不同細(xì)分用途的化合物庫，則能進(jìn)一步整合具有某項(xiàng)作用的盡可能多的化合物。
MCE 對(duì)不同方向、不同種類、性質(zhì)不同的化合物做了詳細(xì)分類，如生物活性化合物庫、FDA 上市庫、天然產(chǎn)物庫等可以供不同需求的科學(xué)家選擇。
隨著技術(shù)的發(fā)展，MCE 化合物庫數(shù)量會(huì)越來越多，分類也越來越精細(xì)，這將大大節(jié)約前期篩選合適化合物所需的時(shí)間。此外，MCE 還可以根據(jù)你的不同需求提供定制庫~
MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報(bào)，我們不為任何個(gè)人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)
參考文獻(xiàn)
1. J P Hughes. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 2011 Mar; 162(6):1239-49.
2. S A Sundberg. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution- and cell-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 2000 Feb;11(1):47-53.
3. Vicky M Avery, David Camp, et al. The Identification of Bioactive Natural Products by High Throughput Screening (HTS). Comprehensive Natural Products II. Volume 3, 2010, Pages 177-203.
4. Michael A Dabrowski 1, Kim Dekermendjian, Per-Eric Lund, Johannes J Krupp, Jon Sinclair, Olof Larsson. Ion channel screening technology. CNS Neurol Disord Drug Targets. 2008 Apr;7(2):122-8.
5. Jin-feng Yue, Guan-hua Qiao, Ni Liu, Fa-jun Nan, Zhao-bing Gao. Novel KCNQ2 channel activators discovered using fluorescence-based and automated patch-clamp-based high-throughput screening techniques. Acta Pharmacol Sin. 2016 Jan; 37(1):105-10.
6. Xin Tang, Jesse Drotar, Keji Li, Cullen D Clairmont, Anna Sophie Brumm, Austin J Sullins, Hao Wu, Xiaoxiao Shawn Liu, Jinhua Wang, Nathanael S Gray, Mriganka Sur, Rudolf Jaenisch. Pharmacological enhancement of KCC2 gene expression exerts therapeutic effects on human Rett syndrome neurons and Mecp2 mutant mice. Sci Transl Med. 2019 Jul 31;11(503):eaau0164.
7. Xiao-Tong Hu, Bing-Lin Zhu, Li-Ge Zhao, Jing-Wen Wang, Lu Liu, Yu-Jie Lai, Ling He, Xiao-Juan Deng, Guo-Jun Chen. Histone deacetylase inhibitor apicidin increases expression of the α-secretase ADAM10 through transcription factor USF1-mediated mechanisms. FASEB J. 2017 Apr;31(4):1482-1493.
8. Zhe-Rui Zhang, Hong-Qing Zhang, Xiao-Dan Li, Cheng-Lin Deng, Zhen Wang, Jia-Qi Li, Na Li. Generation and characterization of Japanese encephalitis virus expressing GFP reporter gene for high throughput drug screening. Antiviral Res. 2020 Oct;182:104884.
9. Peng Wang, Juan-Carlos Alvarez-Perez, et al. A high-throughput chemical screen reveals that harmine-mediated inhibition of DYRK1A increases human pancreatic beta cell replication. Nat Med. 2015 Apr;21(4):383-8.
10. Larisa Goričan, Boris Gole, Uroš Potočnik. Head and Neck Cancer Stem Cell-Enriched Spheroid Model for Anticancer Compound Screening. Cells. 2020 Jul 16;9(7):1707.
11. Vincent Blay, Bhairavi Tolani, Sunita P Ho, Michelle R Arkin. High-Throughput Screening: today's biochemical and cell-based approaches. Drug Discov Today. 2020 Aug 12; S1359-6446(20)30305-6.
更重要的是，隨著分子生物學(xué)和功能基因組的研究發(fā)展，使得新穎靶標(biāo)大量增加，這種情況下，緩慢的人工篩選已經(jīng)沒有辦法滿足新藥研發(fā)的要求，高通量篩選技術(shù)的出現(xiàn)大大縮短了先導(dǎo)物開發(fā)在藥物發(fā)現(xiàn)中的時(shí)間。如今，一個(gè)普通的藥學(xué)高通量篩選實(shí)驗(yàn)室每天篩選的靶標(biāo)已經(jīng)超過 10 萬個(gè)。
高通量篩選技術(shù)
高通量篩選 (High throughput screening，HTS) 技術(shù)包括機(jī)器人技術(shù)、液體處理器、數(shù)據(jù)處理、相當(dāng)多的軟件和敏感的檢測(cè)系統(tǒng)。它是一種藥物發(fā)現(xiàn)過程，可以使生化或細(xì)胞事件能夠重復(fù)和快速測(cè)試化合物數(shù)十萬次。HTS 可根據(jù)待測(cè)樣品的種類大致分為細(xì)胞水平篩選和分子水平篩選兩類。細(xì)胞水平篩選是在細(xì)胞個(gè)體水平上完成的檢測(cè)，由于含有諸如信號(hào)傳導(dǎo)、物質(zhì)代謝等關(guān)于細(xì)胞生命活動(dòng)的信息，因此可以省去體外篩選中的許多步驟。
下面將圍繞細(xì)胞水平篩選介紹幾種常用的檢測(cè)方法：離子通道檢測(cè)、報(bào)告基因檢測(cè)和細(xì)胞增殖檢測(cè)
離子通道檢測(cè)
離子通道是目前藥物發(fā)現(xiàn)的重要靶點(diǎn)。例如在心血管疾病中，離子通道檢測(cè)可以應(yīng)用于原發(fā)性電障礙 (長(zhǎng) QT 綜合癥、短 QT 綜合癥、Brugada 綜合癥) 等方面的藥物篩選。
以 Novel KCNQ2 channel activators discovered using fluorescence-based and automated patch-clamp-based high-throughput screening techniques 一文為例，通過一種改進(jìn)的高通量篩選技術(shù)，篩選新型 KCNQ2 通道激活劑。
在這篇文獻(xiàn)中，作者團(tuán)隊(duì)以 ZTZ240 (KCNQ2 通道激活劑) 作為陽性對(duì)照，通過鉈通量測(cè)定法從 80000 種化合物篩選出了 565 個(gè)比 ZTZ240 更強(qiáng)活性的化合物。然后使用 384 孔自動(dòng)化膜片鉗，進(jìn)一步篩選出了 38 個(gè) KCNQ2 通道激活劑。最后，使用傳統(tǒng)的膜片鉗表征激活劑，得到 ZG1732 和 ZG2083 (EC50 分別為 1.04 μM 和 1.37 μM)。
流程：穩(wěn)定表達(dá) KCNQ2 通道的 CHO 細(xì)胞 → 與染料緩沖液共培養(yǎng) → 在細(xì)胞板中加入不同的化合物孵育 → 鉈通量分析初步篩選 → 384 孔全自動(dòng)膜片鉗系統(tǒng)進(jìn)行撞擊驗(yàn)證 → 自動(dòng)化膜片鉗二次篩選。
圖 2. KCNQ2 通道激活劑的篩類[5]
報(bào)告基因檢測(cè)
報(bào)告基因是一種編碼可被檢測(cè)蛋白質(zhì)或酶的基因，其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定�；趫�(bào)告基因的高通量檢測(cè)方法在 Rett 綜合征、阿爾茲海默癥等其他腦部疾病的治療上是一個(gè)很好的檢測(cè)方向，另外還可以通過構(gòu)建報(bào)告病毒的方式篩選抗病毒藥物。以 Pharmacological enhancement of KCC2 gene expression exerts therapeutic effects on human Rett syndrome neurons and Mecp2 mutant mice 一文為例，作者團(tuán)隊(duì)通過開發(fā)建立了一種應(yīng)用于神經(jīng)元的高通量篩選方法。該文獻(xiàn)中，結(jié)合使用了 CRISPR-Cas9 技術(shù)，將熒光素酶報(bào)告基因插入人 ES 細(xì)胞的內(nèi)源 KCC2 基因位點(diǎn)中，通過檢測(cè)熒光來篩選特異性增強(qiáng) KCC2 達(dá)的化合物，最終從 900 種化合物中篩選出 14 個(gè) KEECs。
流程：培養(yǎng)人類胚胎干細(xì)胞 (ES 細(xì)胞) 結(jié)合 CRISPR-Cas9 技術(shù) → 將熒光素酶報(bào)告基因插入人 ES 細(xì)胞的內(nèi)源 KCC2 基因位點(diǎn) → 高通量篩選出能增強(qiáng) KCC2 表達(dá)的小分子 → 6 次重復(fù)篩選從 900 個(gè)化合物庫中篩選出 14 個(gè)起作用的小分子 → 通過 Western blot 和 RT-PCR 進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證。
圖 3. KEECs 的篩選[6]
細(xì)胞增殖檢測(cè)
細(xì)胞增殖檢測(cè)根據(jù)檢測(cè)內(nèi)容可以分為四類：ATP 濃度檢測(cè)、DNA 合成檢測(cè)、代謝活性檢測(cè)和細(xì)胞增殖相關(guān)抗原檢測(cè)。與細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)合的高通量篩選常用于鑒定能殺死各種癌細(xì)胞或病原體的化合物，還可以應(yīng)用于細(xì)胞缺陷疾病的藥物篩選。
以 Head and Neck Cancer Stem Cell-Enriched Spheroid Model for Anticancer Compound Screening 為例，作者團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種程序簡(jiǎn)單，培養(yǎng)時(shí)間短的干細(xì)胞富集球形模型 (SCESM)，適用于抗癌癥干細(xì)胞化合物的新高通量篩選方法 (HTSs)。
流程：特定細(xì)胞培養(yǎng) 7 天 → 含不同實(shí)驗(yàn)化合物的處理培養(yǎng)基替代掉一半莖培養(yǎng)液，處理 5 天 → 用 0.5% triton X-100 (Sigma-Aldrich) 在 4℃ 過夜培養(yǎng) → 用 7-AAD 和 Ki67 共染細(xì)胞 → 共聚焦顯微鏡捕獲熒光信號(hào) → 用 qPCR，F(xiàn)low cytometry，Western blot 驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果。
圖 4. 抗癌癥干細(xì)胞化合物篩選[10]
高通量篩選的實(shí)驗(yàn)方法必須具備條件穩(wěn)定，樣本之間差異性小，容易檢測(cè)，且可以大批量同時(shí)檢測(cè)等特性。除了以上介紹的三種較為常用的方法之外，第二信使檢測(cè)、細(xì)胞活力檢測(cè)等方法也是常用的細(xì)胞水平的檢測(cè)手段。
化合物庫的使用在篩選前期也起著十分重要的作用。在化合物未知的情況下，數(shù)量足夠大的化合物庫可增加識(shí)別目標(biāo)的概率；不同細(xì)分用途的化合物庫，則能進(jìn)一步整合具有某項(xiàng)作用的盡可能多的化合物。
MCE 對(duì)不同方向、不同種類、性質(zhì)不同的化合物做了詳細(xì)分類，如生物活性化合物庫、FDA 上市庫、天然產(chǎn)物庫等可以供不同需求的科學(xué)家選擇。
隨著技術(shù)的發(fā)展，MCE 化合物庫數(shù)量會(huì)越來越多，分類也越來越精細(xì)，這將大大節(jié)約前期篩選合適化合物所需的時(shí)間。此外，MCE 還可以根據(jù)你的不同需求提供定制庫~
圖 5. 化合物庫定制流程
| 相關(guān)產(chǎn)品 |
| 膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白/離子通道化合物庫 MCE 收錄的 800+ 小分子調(diào)節(jié)劑可用于離子通道和膜轉(zhuǎn)運(yùn)體的研究，或相關(guān)藥物的高通量篩選。 |
| 抗阿爾茨海默病化合物庫 MCE 收錄了 600+ 種具有抗阿爾茲海默病活性的化合物及靶向阿爾茲海默病主要靶點(diǎn)的化合物。MCE 抗阿爾茲海默病化合物是研究阿爾茲海默病發(fā)病機(jī)制及開發(fā)抗阿爾茲海默病藥物的有用工具。 |
| 生物活性化合物庫 MCE 收錄了 11,000+ 種具有明確報(bào)道的、活性已知、靶點(diǎn)明確的小分子化合物，包括天然產(chǎn)物，新型化合物，已上市化合物及處于臨床期化合物等，可以用于信號(hào)通路研究，新藥研發(fā)，老藥新用等不同的篩選目的。 |
| FDA 上市庫 MCE 收錄了 2,300+ 個(gè)批準(zhǔn)上市的化合物，這些化合物已經(jīng)完成了廣泛的臨床前和臨床研究，具有良好的生物活性、安全性和生物利用度。 |
| 天然產(chǎn)物庫 MCE 收錄了 2,800+ 種天然產(chǎn)物，包括糖類和糖苷，苯丙素類，醌類，黃酮類，萜類，類固醇，生物堿，酚類，酸和醛等，天然產(chǎn)物化合物庫是一種有用的藥物開發(fā)工具。 |
參考文獻(xiàn)
1. J P Hughes. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 2011 Mar; 162(6):1239-49.
2. S A Sundberg. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution- and cell-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 2000 Feb;11(1):47-53.
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6. Xin Tang, Jesse Drotar, Keji Li, Cullen D Clairmont, Anna Sophie Brumm, Austin J Sullins, Hao Wu, Xiaoxiao Shawn Liu, Jinhua Wang, Nathanael S Gray, Mriganka Sur, Rudolf Jaenisch. Pharmacological enhancement of KCC2 gene expression exerts therapeutic effects on human Rett syndrome neurons and Mecp2 mutant mice. Sci Transl Med. 2019 Jul 31;11(503):eaau0164.
7. Xiao-Tong Hu, Bing-Lin Zhu, Li-Ge Zhao, Jing-Wen Wang, Lu Liu, Yu-Jie Lai, Ling He, Xiao-Juan Deng, Guo-Jun Chen. Histone deacetylase inhibitor apicidin increases expression of the α-secretase ADAM10 through transcription factor USF1-mediated mechanisms. FASEB J. 2017 Apr;31(4):1482-1493.
8. Zhe-Rui Zhang, Hong-Qing Zhang, Xiao-Dan Li, Cheng-Lin Deng, Zhen Wang, Jia-Qi Li, Na Li. Generation and characterization of Japanese encephalitis virus expressing GFP reporter gene for high throughput drug screening. Antiviral Res. 2020 Oct;182:104884.
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