RNA甲基化修飾是表觀遺傳學(xué)方中調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的關(guān)鍵過程，目前對(duì)m6A RNA甲基化修飾的研究已進(jìn)行的如火如荼，但除了m6A以外仍有多種RNA甲基化修飾參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)，其中m5C甲基化修飾在近期的研究中也不斷有高分文章的出現(xiàn)（如表1）。云序生物是國(guó)內(nèi)RNA修飾測(cè)序的領(lǐng)跑者，可針對(duì)mRNA和各種非編碼RNA提供各類RNA修飾測(cè)序服務(wù) (m6A﹑m6Am、m1A﹑m5C﹑m7G﹑ac4C﹑2’-O-甲基化等)。目前，云序已累計(jì)支持客戶發(fā)表53篇高水平文章，合計(jì)影響因子460+分，是國(guó)內(nèi)支持發(fā)文最多、累計(jì)影響因子最高的公司。

2021年初，發(fā)表在《Nucleic Acids Research》上關(guān)于m5C的文章研究了NSUN6可做為m5C mRNA甲基化修飾酶，可能參與mRNA翻譯過程。此外也有多篇文章報(bào)道了m5C在眾多研究方向的機(jī)制。那么這個(gè)最新領(lǐng)域具體有哪些進(jìn)展？有哪些新型的方法思路值得我們借鑒呢？小編匯集了近期m5C修飾文章，帶大家把握這一領(lǐng)域的最新進(jìn)展。

 

1. m5C——NSUN6介導(dǎo)m5C mRNA甲基化修飾的序列和結(jié)構(gòu)特異性

發(fā)表期刊：Nucleic Acids Research
影響因子：11.501
文章鏈接：Sequence- and structure-specific cytosine-5 mRNA methylation by NSUN6
高豐度的m6A RNA修飾對(duì)mRNA功能具有十分重要調(diào)控作用，而m5C修飾的功能在很大程度上仍不為人知。本文中作者使用甲基化依賴的miCLIP技術(shù)結(jié)合RNA bis-seq測(cè)定了人類轉(zhuǎn)錄組中的m5C修飾位點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NSUN6是一種甲基轉(zhuǎn)移酶，對(duì)mRNA具有很強(qiáng)的底物特異性。NSUN6主要作用于3’UTR區(qū)的保守基序CTCCA。敲除和回復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示，NSUN6靶向調(diào)控mRNA甲基化。核糖體分析進(jìn)一步證明NSUN6特異性甲基化與翻譯終止相關(guān)。雖然NSUN6在小鼠胚胎發(fā)育中是必不可少的，但它在人類腫瘤中表達(dá)下調(diào)，且NSUN6的高表達(dá)的某些癌癥患者有更好的預(yù)后�？傊�，該研究確定NSUN6是靶向mRNA的m5C甲基轉(zhuǎn)移酶，可能是參與翻譯終止保真度的質(zhì)量控制機(jī)制的一部分。

圖例1：miCLIP檢測(cè)m5C修飾位點(diǎn)。
 

2. m5C——m5C RNA修飾介導(dǎo)秀麗隱桿線蟲中熱脅迫的翻譯適應(yīng)性
發(fā)表期刊：EMBO J
影響因子：9.889
文章鏈接：Translational adaptation to heat stress is mediated by RNA 5-methylcytosine in Caenorhabditis elegans
m5C是RNA轉(zhuǎn)錄后的甲基化修飾，發(fā)現(xiàn)在生命中廣泛存在。雖然已經(jīng)對(duì)m5C-甲基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行了研究，但m5C修飾對(duì)整體的發(fā)育、穩(wěn)態(tài)和應(yīng)激的影響仍然未知。本研究中使用秀麗隱桿線蟲生成了第一個(gè)RNA中沒有m5C的生物體，證明了這種修飾是不必要的。作者測(cè)定了在體內(nèi)RNA上的m5C位點(diǎn)定位和酶特異性，結(jié)果表明缺乏m5C修飾的動(dòng)物對(duì)溫度較為敏感。在分子水平上，作者發(fā)現(xiàn)m5C的缺失影響亮氨酸和脯氨酸的解碼，從而降低富含這些氨基酸的轉(zhuǎn)錄本的翻譯效率。最終發(fā)現(xiàn)亮氨酸UUG密碼子的翻譯受熱激影響最大，說明m5C tRNA甲基化對(duì)熱脅迫的適應(yīng)過程起重要作用。
 

3. m5C——哺乳動(dòng)物RNA胞苷的雙甲基化研究

發(fā)表期刊：Chemical Science
影響因子：9.346
文章鏈接：Novel dual methylation of cytidines in the RNA of mammals
RNA修飾在調(diào)節(jié)各種生理過程中發(fā)揮著重要作用。甲基化是RNA中最普遍的修飾。在哺乳動(dòng)物RNA中有三種同分異構(gòu)體胞苷甲基化修飾，包括m3C、m4C、m5C。除了胞苷堿基上的單甲基化，也有報(bào)道在核糖的2’羥基和胞苷的堿基上n能發(fā)生雙甲基化修飾，包括m4Cm和m5Cm。在大腸桿菌的16S rRNA中發(fā)現(xiàn)了m4Cm，而m5Cm在末端嗜熱古菌和哺乳動(dòng)物的tRNA中發(fā)現(xiàn)。但是，與m4Cm和m5Cm不同的是，推測(cè)的m3Cm雙甲基化從未在生物體中被發(fā)現(xiàn)。因此，m3Cm在RNA中是否存在仍然是一個(gè)懸而未決的問題。在目前的研究中，作者合成了m3Cm，并建立了LC-ESI-MS/MS法測(cè)定胞苷二甲基化。在優(yōu)化的分析條件下，m3Cm、m4Cm和m5Cm可以被清楚地分辨出來。利用該方法發(fā)現(xiàn)了m3Cm存在于哺乳動(dòng)物RNA中。作者確認(rèn)了m3Cm主要存在于哺乳動(dòng)物小RNA (<200 nt)中。此外，作者第一次確認(rèn)了m4Cm在哺乳動(dòng)物細(xì)胞18S rRNA中的存在。同位素示蹤表明，S -腺苷-L-蛋氨酸是RNA胞苷三種二甲基化的甲基供體。m3Cm的發(fā)現(xiàn)拓寬了生物體內(nèi)RNA修飾的多樣性。此外，m3Cm、m4Cm在哺乳動(dòng)物中的發(fā)現(xiàn)為理解RNA修飾介導(dǎo)的RNA加工和基因表達(dá)調(diào)控開辟了新的方向。
4. m5C——RNA甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN6通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖抑制胰腺癌的發(fā)生
發(fā)表期刊：EBioMedicine
影響因子：5.736
文章鏈接：The RNA methyltransferase NSUN6 suppresses pancreatic cancer development by regulating cell proliferation
胰腺癌(PC)由于其細(xì)胞過度增殖和侵襲性轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)成為世界上最致命的實(shí)體惡性腫瘤之一。有證據(jù)顯示，RNA轉(zhuǎn)錄后修飾在PC進(jìn)展中有重要作用。然而，關(guān)于PC中m5C RNA修飾的研究仍非常有限。在本研究中，作者采用定量PCR (qPCR)和免疫組化(IHC)方法檢測(cè)362例正常人和382例腫瘤標(biāo)本中與mvc相關(guān)的候選基因和蛋白表達(dá)情況。MTS法檢測(cè)PC細(xì)胞增殖率。用異種移植小鼠模型來評(píng)估NSUN6在PC腫瘤形成中的作用。通過分析4個(gè)基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(GEO)，在3個(gè)獨(dú)立的PC隊(duì)列中選擇了6個(gè)m5C相關(guān)基因，這些基因表現(xiàn)出顯著且一致的變化，并進(jìn)行進(jìn)一步檢查。最后，作者確定NSUN6的約簡(jiǎn)是所有PC樣本集檢測(cè)的共同特征。NSUN6表達(dá)與臨床病理參數(shù)包括T分期和Ki67+細(xì)胞率相關(guān)。進(jìn)一步評(píng)估50個(gè)PC組織的轉(zhuǎn)錄譜，發(fā)現(xiàn)在NSUN6低表達(dá)組中，細(xì)胞周期和G2M檢查點(diǎn)等與細(xì)胞增殖相關(guān)的生物過程豐富。在體外PC細(xì)胞系和體內(nèi)異種移植小鼠模型的幫助下，證實(shí)了NSUN6在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和PC腫瘤生長(zhǎng)中的作用。最后展示了NSUN6在評(píng)估PC患者腫瘤復(fù)發(fā)和生存率方面的良好表現(xiàn)。上述數(shù)據(jù)表明，NSUN6是調(diào)節(jié)PC細(xì)胞增殖的重要因素，并強(qiáng)調(diào)了基于mcc的新型臨床模式作為PC患者治療方法的潛力。

5. m5C——HIF-1α/ALYREF/PKM2調(diào)控通路在膀胱癌糖酵解和腫瘤發(fā)生中的作用
發(fā)表期刊：Cancer Communications
影響因子：5.627
文章鏈接：The role of the HIF-1α/ALYREF/PKM2 axis in glycolysis and tumorigenesis of bladder cancer
作為糖酵解的限速酶，丙酮酸激酶肌同工酶M2 (PKM2)參與腫瘤的代謝和生長(zhǎng)。PKM2在腫瘤中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，在膀胱癌中的研究尚不充分。研究發(fā)現(xiàn)PKM2 mRNA的m5C修飾可能參與了膀胱癌的發(fā)病機(jī)制。本研究首先證明了膀胱癌中ALYREF可穩(wěn)定PKM2 mRNA并結(jié)合到其3'-UTR區(qū)的m5C位點(diǎn)。ALYREF的過表達(dá)可通過PKM2介導(dǎo)的糖酵解促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖。此外，PKM2和ALYREF高表達(dá)預(yù)示膀胱癌患者生存期較差。最后，作者發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)因子-1α (HIF-1α)除了直接激活A(yù)LYREF的轉(zhuǎn)錄外，還通過激活其間接上調(diào)PKM2的表達(dá)。綜上所述HIF-1α/ALYREF/PKM2軸中PKM2 mRNA的m5C修飾可能促進(jìn)膀胱癌的糖代謝，為膀胱癌提供了一個(gè)新的有前景的治療靶點(diǎn)。
 

云序生物m5C甲基化研究五大模塊

01 m5C RNA甲基化測(cè)序
m5C RNA甲基化測(cè)序（m5C-seq）
對(duì)m5C RNA甲基化，目前最流行的檢測(cè)手段為m5C-Seq技術(shù)，適用于m5C RNA甲基化譜研究，快速篩選m5C RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m5C測(cè)序：

• m5C 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）
• m5C  LncRNA測(cè)序（涵蓋LncRNA和mRNA）
• m5C  Pri-miRNA測(cè)序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）
• m5C  mRNA測(cè)序

02 檢測(cè)整體m5C RNA甲基化水平
 LC-MS/MS檢測(cè)整體RNA甲基化水平
精準(zhǔn)高效，可以實(shí)現(xiàn)一次檢測(cè)，9類修飾水平檢測(cè)，一步到位。
03 m5C RNA甲基化上游酶的篩選
 m5C RNA甲基化相關(guān)酶PCR芯片
尋找上游直接調(diào)控m5C RNA甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶。
04 m5C RNA甲基化靶基因驗(yàn)證
 meRIP-qPCR
云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務(wù)，可針對(duì)mRNA，lncRNA，環(huán)狀RNA等不同類型的RNA分子進(jìn)行檢測(cè)，低通量驗(yàn)證RNA修飾靶基因表達(dá)水平。
05機(jī)制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
篩選或驗(yàn)證RNA修飾直接靶點(diǎn)，研究RNA修飾靶基因的調(diào)控機(jī)制。
5.2  RNA pull down -MS/WB
篩選或驗(yàn)證目標(biāo)RNA互作基因或蛋白，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制。
5.3 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)
驗(yàn)證兩基因互作，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制。
 

云序生物服務(wù)優(yōu)勢(shì)

優(yōu)勢(shì)一：發(fā)表10分以上文章最多的RNA甲基化測(cè)序服務(wù)平臺(tái)。云序已累計(jì)支持客戶發(fā)表53+篇高水平文章，合計(jì)影響因子460分+，是國(guó)內(nèi)支持發(fā)文最多、累計(jì)影響因子最高的公司。
優(yōu)勢(shì)二：至今完成4000+例 RNA甲基化測(cè)序樣本，全面覆蓋醫(yī)口、農(nóng)口等各類樣本。
優(yōu)勢(shì)三：全面檢測(cè)mRNA和各類非編碼RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。
優(yōu)勢(shì)四：獨(dú)家提供m5C一站式服務(wù)：m5C整體水平檢測(cè)、m5C測(cè)序、MeRIP-qPCR驗(yàn)證、RIP和RNA pull-down等。
優(yōu)勢(shì)五：率先研發(fā)超微量MeRIP測(cè)序技術(shù)，RNA量低至500ng起。
優(yōu)勢(shì)六：國(guó)內(nèi)最全的RNA修飾測(cè)序平臺(tái)，提供m6A、m6Am、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙�；�和2'-O-甲基化測(cè)序。